《表1 HOTAIR野生型、突变型及HLA-G野生型、突变型引物序列》

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《HOTAIR上调miR-152靶向调控HLA-G的生物信息作用预测与验证》

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下划线为潜在结合位点及突变位点

根据靶基因与miR-152-3p结合的序列，设计野生型及突变型PCR扩增引物序列，见表1。化学合成以上序列，合成时在序列两端加上SacⅠ和XhoⅠ酶切位点，用退火的方法得到目的序列双链模板。为将目的序列片段克隆到GP-miRGLO载体中，先采用SacⅠ和XhoⅠ对GP-miRGLO载体进行酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳，用DNA凝胶回收试剂盒回收双酶切后的载体条带，然后采用T4 DNA连接酶连接目的片段与双酶切后的GP-miRGLO载体。将连接产物转化入感受态细胞，并将培育后的细胞接种于含50 mg/L氨苄青霉素的LB平板上，置37℃培养箱培养16 h。筛选阳性克隆，质粒小提试剂盒抽提质粒。重组质粒送上海吉玛公司测序，测序结果与目的基因序列比对后，筛选出构建成功的目的基因表达质粒，并对筛选出的阳性克隆进行超纯去内毒素抽提，得到足够量的重组质粒。