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第一章基因与基因工程1

一、基因研究的发展1

1.基因学说的创立1

2.基因与DNA分子3

3.基因与DNA的多核苷酸区段5

4.基因与多肽链6

5.基因的碱基顺序与蛋白质的氨基酸顺序7

6.基因的表达与调控10

7.基因的分离11

8.基因的合成14

二、基因的现代概念15

1.移动基因15

2.断裂基因17

3.重叠基因19

4.假基因20

5.重复序列及重复基因22

三、基因工程的诞生及其主要的研究内容24

1.基因工程的诞生24

2.基因工程的定义及其主要的研究内容28

四、有关基因工程安全性的争论29

第二章基因操作的基本技术34

一、凝胶电泳34

二、核酸分子杂交36

1.萨瑟恩DNA吸印杂交技术37

2.诺塞恩RNA吸印杂交技术38

3.菌落（或噬菌斑）杂交技术40

三、细菌转化41

四、DNA核苷酸序列分析技术43

1.Sanger 双脱氧链终止法44

（1） Sanger双脱氧链终止法的基本原理44

（2） Sanger 双脱氧-M13体系DNA序列分析法45

（3） Sanger 双脱氧-pUC体系DNA序列分析法48

2.Maxam-Gilbert化学修饰法51

（1） Maxam-Gilbert化学修饰法的基本原理51

（2）碱基特异的化学切割反应51

（3） Maxam-Gilbert化学修饰-CS载体系统DNA序列分析法54

（4） Maxam-Gilbert化学修饰法的优点54

3.DNA序列分析法的自动化55

五、基因的化学合成56

1.基因化学合成的概况56

2.磷酸二酯法合成寡核苷酸57

3.磷酸三酯法合成寡核苷酸59

4.固相亚磷酸三酯法合成寡核苷酸60

5.用寡核苷酸片段组装基因的方式61

6.寡核苷酸化学合成的实际用途62

（1）作为合成基因的元件63

（2）作为核苷酸序列分析的引物63

（3）作为核酸分子杂交的探针63

（4）用于定点突变研究64

六、寡核苷酸诱发的基因定点突变64

1.寡核苷酸诱发基因定点突变的原理64

2.寡核苷酸诱发基因定点突变的过程65

（1）正链DNA的合成65

（2）突变引物的合成65

（3）异源双链DNA分子的制备65

（4）闭环异源双链DNA分子的富集65

（5）转化65

（6）突变体的筛选66

（7）突变基因的鉴定67

第三章基因克隆的酶学基础68

一、核酸内切限制酶与DNA分子的体外切割68

1.寄主控制的限制与修饰现象68

2.核酸内切限制酶的类型70

3.Ⅱ型核酸内切限制酶的基本特性74

4.核酸内切限制酶的命名法78

5.影响核酸内切限制酶活性的因素79

（1） DNA的纯度79

（2） DNA的甲基化程度79

（3）酶切消化反应的温度80

（4） DNA的分子结构80

（5）核酸内切限制酶的缓冲液81

二、DNA连接酶与DNA分子的体外连接81

1.DNA连接酶81

2.粘性末端DNA片段的连接84

3.平末端DNA片段的连接86

4.用化学合成的衔接物连接DNA分子87

三、DNA聚合酶91

1.DNA聚合酶Ⅰ与核酸杂交探针的制备91

（1）DNA聚合酶Ⅰ91

（2） DNA缺口转移93

（3） DNA杂交探针的制备95

2.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段与DNA末端标记95

3.T4 DNA聚合酶和取代合成法标记DNA片段96

4.依赖于RNA的DNA聚合酶与互补DNA的合成98

5.T7 DNA聚合酶99

6.修饰的T7 DNA聚合酶100

四、DNA及RNA的修饰酶101

1.末端脱氧核苷酸转移酶与同聚物加尾101

2.T4多核苷酸激酶与DNA分子5′-末端的标记103

3.碱性磷酸酶与DNA脱磷酸作用104

五、核酸外切酶106

1.核酸外切酶Ⅶ （exoⅦ）106

2.核酸外切酶Ⅲ （exoⅢ）106

3.λ核酸外切酶（λexo）和T7基因6核酸外切酶108

六、单链核酸内切酶109

1.λ核酸酶与RNA分子定位109

2.Bal31核酸酶与限制位点的确定111

第四章基因克隆的质粒载体113

一、质粒的一般生物学特性113

1.质粒DNA113

2.质粒DNA的转移114

3.质粒DNA的迁移作用117

4.质粒DNA的复制类型119

5.质粒的不亲和性120

二、质粒DNA的复制与拷贝数的控制121

1.质粒DNA复制的多样性121

2.多拷贝质粒ColEI DNA复制的一般特性121

3.质粒DNA拷贝数的控制122

4.杂种质粒DNA拷贝数的控制124

三、质粒载体的选择125

1.用作克隆载体的质粒必须具备的基本条件125

2.载体类型的选择126

（1）高拷贝数质粒载体的选用126

（2）低拷贝数质粒载体的选用127

（3）插入失活型质粒载体的选用127

3.质粒载体的选择记号128

四、大肠杆菌质粒载体129

1.pSC101质粒载体129

（1）应用pSC101质粒作基因克隆载体的实例Ⅰ——葡萄球菌质粒基因在大肠杆菌中的表达131

（2）应用pSC101质粒作基因克隆载体的实例Ⅱ——在大肠杆菌中克隆非洲爪蟾DNA133

2.ColEI质粒载体133

3.pBR322质粒载体134

（1） pBR322质粒载体的构建134

（2） pBR322质粒DNA分子的结构特点137

（3） pBR322质粒的改良139

（4）应用pBR 322质粒作为基因克隆载体的实例——水稻叶绿体光诱导基因psbA的结构分析141

4.其它的大肠杆菌质粒载体142

（1）低拷贝数的质粒载体142

（2）直接选择的质粒载体143

（3）失控的质粒载体145

第五章噬菌体载体和柯斯载体146

一、噬菌体的一般生物学特性146

1.噬菌体的结构及其核酸类型146

2.噬菌体的感染性147

3.噬菌体的溶菌生命周期148

4.噬菌体的溶源生命周期149

5.重组体噬菌体的分离153

二、λ噬菌体载体154

1.λ噬菌体分子生物学概述155

2.λ噬菌体载体的构建159

（1）多余限制位点的消除——λ噬菌体改建的基本原理159

（2）插入型载体162

A.免疫功能失活的插入型载体162

B.β-半乳糖苷酶失活的插入型载体162

（3）替换型载体163

（4） Spi-正选择的替换型载体164

3.λ重组体DNA分子的体外包装167

（1） λ重组体DNA分子的转染作用167

（2） λDNA的体外包装168

（3） λ噬菌体DNA的包装限制问题170

4.重组噬菌体的成熟171

5.克隆在λ噬菌体载体上的外源基因的表达171

三、凯伦噬菌体载体173

四、柯斯质粒载体174

1.柯斯质粒载体的构建174

2.柯斯质粒载体的特点175

3.柯斯克隆175

五、单链DNA噬菌体载体180

1.M13噬菌体的生物学特性180

2.M13克隆体系182

3.M13载体系列的发展183

4.M13载体系列的优点187

第六章 基因的分离与鉴定190

一、DNA克隆片段的产生与分离190

1.基因组DNA的片段化190

2.DNA片段的大小分部192

3.编码目的基因的克隆片段的富集193

二、重组体DNA分子的构建193

1.载体DNA的分离194

2.含有目的基因的外源DNA片段同载体分子的重组196

（1）外源DNA片段定向插入载体分子196

（2）非互补粘性末端DNA分子的连接197

（3）最佳连接反应199

三、重组体分子导入受体细胞201

1.重组体DNA分子的转化或转染201

2.体外包装的λ噬菌体之转导202

四、基因克隆的实验方案203

1.互补作用克隆206

2.cDNA基因文库207

（1）不同丰度mRNA的cDNA克隆207

A.高丰度mRNA的cDNA克隆207

B.低丰度mRNA的cDNA克隆209

C.稀少mRNA的cDNA克隆209

（2） cDNA克隆的优越性210

3.基因组DNA克隆212

（1）用λ噬菌体载体构建基因组DNA基因文库212

（2）利用柯斯质粒作载体构建基因组DNA基因文库214

五、重组体分子的选择与鉴定216

1.遗传检测法216

（1）根据载体提供的表型特征选择重组体分子的直接选择法216

A.抗药性记号插入失活选择法216

B.β-半乳糖苷酶显色反应选择法219

（2）根据插入序列提供的表型特征选择重组体分子的直接选择法221

2.物理检测法222

（1）凝胶电泳检测法223

（2） R-环检测法223

3.核酸杂交检测法223

4.免疫化学检测法225

（1）放射性抗体检测法226

（2）免疫沉淀检测法228

（3）表达载体产物之免疫化学检测法229

5.转译筛选法231

（1）杂交抑制的转译231

（2）杂交选择的转译231

6.正负筛选法232

第七章真核基因在大肠杆菌中的表达234

一、引言234

二、基因表达的基本问题236

1.转录236

（1） RNA合成的化学特性236

（2） RNA合成的不同阶段237

（3）RNA分子的类型240

（4）真核生物的转录242

2.转译244

（1）转译的概述244

（2）转译的三个步骤246

三、真核基因在大肠杆菌细胞中的表达250

1.理论问题250

2.克隆基因表达的基本条件251

3.增强外源蛋白质稳定性的途径252

4.克隆基因表达的检测254

四、原核生物的表达载体256

1.lac启动子的表达载体256

2.trp启动子的表达载体259

3.PL启动子的表达载体261

五、高等真核基因在大肠杆菌中表达的实例263

1.合成的脑激素基因在大肠杆菌细胞中的表达263

2.胰岛素基因在大肠杆菌细胞中的表达266

六、提高克隆基因表达水平的途径270

1.启动子结构对表达效率的影响270

2.转译起始序列对表达效率的影响270

3.启动子同克隆基因间隔距离对表达效率的影响271

4.质粒拷贝数对表达效率的影响275

5.转录终止区对克隆基因表达效率的影响275

6.质粒分离的不稳定性对克隆基因表达效率的影响276

7.质粒稳定性对克隆基因表达效率的影响276

第八章植物基因工程278

一、引 言278

二、植物基因工程的主要研究方向279

1.提高光合作用效率的植物基因工程基础研究279

（1）光合作用概述279

（2）光合作用基因工程的主要目标280

（3）叶绿体基因结构与功能的研究是开展光合作用基因工程的重要基础281

2.生物固氮与固氮基因的转移282

（1）根瘤菌的固氮作用282

（2）固氮酶复合体284

（3）生物固氮的基因工程284

3.增加种子的营养价值285

4.提高农作物抗病虫害及除草剂的能力287

（1）培育抗病虫害的农作物287

（2）培育抗除草剂的农作物288

5.增加植物次生代谢产物的产率288

三、植物基因转移的病毒载体289

1.单链RNA植物病毒289

2.单链DNA植物病毒291

3.双链DNA植物病毒292

（1）花椰菜花叶病毒组的一般生物学特性293

（2） CaMV DNA的特性293

（3） CaMV DNA核酸内切限制酶切割图谱294

（4） CaMV的生活史模式297

4.花椰菜花叶病毒DNA载体297

（1） CaMV DNA的表达297

（2） DNA的缺失或插入与CaMV的感染性298

（3） CaMV克隆载体的发展299

A.互补载体系统299

B.混合载体系统299

C.CaMV 35S启动子融合基因载体系统300

（4） CaMV DNA作为克隆载体的评价300

四、植物基因转移的质粒载体301

1.病原土壤杆菌301

2.植物冠瘿的诱发与冠瘿细胞的特性303

3.Ti质粒的遗传特性306

（1）冠瘿瘤诱发之遗传本质306

（2） Ti质粒的遗传功能307

（3）以Ti质粒为媒介的接合转移307

（4） Ti质粒的限制图及基因图308

4.T-DNA的结构与功能309

（1） Ti质粒与T-DNA309

（2） T-DNA的整合机理309

（3） T-DNA的结构与功能310

5.Ti质粒载体的构建311

（1） T-DNA转化的选择记号311

（2）共合载体法312

（3） 双元载体系统314

A.双元Ti载体系统314

B.无T-DNA的双元系统316

（4）隔端载体法317

6.Ri质粒载体系统319

五、培育转基因植物的实验方法319

1.根瘤土壤杆菌的转化319

（1）两步接合转移法320

（2）三亲株杂交转移法320

2.植物细胞的转化321

（1）创伤植株感染法321

（2）原生质体共培养法转化植物细胞323

（3）叶盘法转化植物细胞324

（4）土壤杆菌对单子叶植物的感染问题325

第九章哺乳动物基因工程327

一、哺乳动物基因转移的遗传选择标记327

1.嘌呤和嘧啶的生物合成327

2.胸苷激酶基因选择系统327

（1） tk-细胞327

（2） HAT选择法328

（3）共转化选择329

3.二氢叶酸还原酶基因选择系统329

（1）基本原理329

（2）显性选择330

4.氯霉素乙酰转移酶基因选择系统331

（1） CAT质粒331

（2） CAT酶活性的测定331

5.黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因选择系统332

6.氨基糖苷磷酸转移酶基因选择系统333

二、外源DNA导入哺乳动物细胞的方法334

1.磷酸钙转染技术334

（1）磷酸钙转染的基本步骤334

（2）影响磷酸钙转染效率的因素334

2.DEAE-葡聚糖转染技术336

（1） DEAE-葡聚糖转染的一般程序336

（2）DEAE-葡聚糖转染的可能机理及影响因素336

（3） DEAE-葡聚糖转染法的评价336

3.聚阳离子-DMSO转染技术337

4.基因显微注射技术337

（1）显微注射法337

（2）穿刺法338

5.电穿孔DNA转染技术338

（1）基本原理338

（2）操作程序338

（3）影响因素339

6.脂质体载体法339

三、SV40病毒载体340

1.SV40病毒的基本生物学特性340

（1） SV40病毒的生活周期340

（2） SV40病毒的基础分子生物学341

2.SV40病毒载体的发展342

（1）取代型重组病毒载体343

A.晚期区段取代载体343

①在猿猴细胞中表达大鼠前胰岛素基因的晚期区段取代载体343

②在猴肾细胞中表达兔β-珠蛋白基因的晚期区段取代载体343

B.早期区段取代载体345

（2）重组的病毒-质粒载体346

A.含有完整早期区段和复制起点的病毒-质粒载体346

B.微型病毒复制子-质粒载体347

四、反转录病毒载体347

1.反转录病毒的一般生物学特性347

（1）生活周期348

（2）反转录病毒基因组的特点348

（3）反转录病毒的复制349

（4）原病毒DNA的表达349

A.原病毒DNA的结构特点349

B.原病毒DNA的转录与转译351

C.原病毒DNA的表达与肿瘤的诱发352

2.反转录病毒载体的主要类型352

（1）辅助病毒互补的重组的反转录病毒质粒载体352

（2）不需要辅助病毒互补的重组的反转录病毒质粒载体353

（3）广寄主的反转录病毒载体354

（4）反转录病毒表达载体354

A.反转录病毒表达载体的构建355

B.影响表达效率的因素355

五、其它的病毒载体356

1.痘苗病毒载体356

（1）痘苗病毒的特性356

（2）痘苗病毒载体的构建356

2.乳头状瘤病毒载体357

（1）牛乳头状瘤病毒基因组的结构特点357

（2）牛乳头状瘤病毒载体353

A.简单的载体358

B.穿梭载体358

3.腺病毒载体359

（1）腺病毒的一般生物学特性359

（2） 腺病毒载体的构建360

第十章重组DNA技术的应用361

一、重组DNA技术与医学研究361

1.癌症研究361

（1）致癌基因361

（2）细胞癌化363

A.蛋白质激酶363

B.ras族致癌基因363

C.myc族致癌基因364

2.爱滋病研究364

（1） HIV基因组结构366

（2） HIV病毒的生命周期366

（3）爱滋病的预防与治疗366

3.基因治疗367

（1）基因治疗的主要目标367

（2）使用反转录病毒载体进行基因治疗368

（3）哺乳动物细胞基因点射368

4.重组DNA探针与遗传病诊断370

（1）遗传性疾病的产前诊断370

（2）胎儿的DNA分析370

二、重组DNA技术与疫苗生产371

1.疫苗的设计372

2.重组亚基疫苗372

（1）抗乙型肝炎病毒（HB V）的重组亚基疫苗372

（2）抗其它病毒的重组亚基疫苗374

3.重组病毒活疫苗374

（1）重组痘苗病毒疫苗374

（2）对重组病毒活疫苗的评价375

三、重组DNA技术与工业生产375

1.纤维素的开发利用375

2.酿酒工业376

3.干酪生产377

4.新型蛋白质的生产377

四、重组DNA技术与农业378

1.转基因植物378

2.转基因动物379

主要参考文献380

名词术语解释382

索引388