《基因及其操作原理》求取 ⇩

第1章 绪论1

第2章 基因的概念及其发展10

2.1基因组的表观差异10

2.1.1 原核和真核基因组的比较10

2.1.2 DNA的重复序列10

2.1.3 卫星DNA(s-DNA)12

2.1.4 DNA插入顺序12

2.1.5 内含子12

2.1.6 DNA的非编码序列14

2.1.7 基因组中的非表达基因14

2.1.8 功能上相似的基因族15

2.2 基因特性的理解15

2.4 基因的现代概念17

2.3 原核和真核基因的类型17

2.4.1 可移动基因18

2.4.2 断裂基因19

2.4.3 重叠基因20

2.4.4 假基因21

2.4.5 反转子及反转录基因22

第3章基因工程的工具酶31

3.1 限制性核酸内切酶31

3.1.1 限制性核酸内切酶的发现和生物功能31

3.1.2 Ⅰ型和Ⅲ型限制性核酸内切酶33

3.1.3 Ⅱ型限制性核酸内切酶34

3.2 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ48

3.3 T4DNA聚合酶49

3.4 T4DNA连接酶50

3.5 逆转录酶51

3.6 核酸酶SI52

3.7 末端脱氧核苷酸转移酶53

3.8 脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ)53

3.9 外核酸酶Ⅲ54

3.10 外核酸酶Bal3154

3.11 T4多核苷酸激酶55

3.12 碱性磷酸化酶57

第4章基因工程的载体58

4.1 质粒58

4.1.1 质粒的一般性质和研究意义58

4.1.2 质粒的研究历史60

4.1.3 质粒的类型60

4.1.4 大肠杆菌质粒载体61

4.1.6 农杆菌T1质粒载体69

4.1.5 枯草杆菌质粒载体69

4.1.7 质粒的复制73

4.2 细菌噬菌体λ79

4.2.1 噬菌体λ的一般性质79

4.2.2 λ噬菌体载体82

4.2.3 噬菌体λ重组DNA分子的体外包装85

4.3 Cosmid(科斯质粒)85

4.4 单链DNA噬菌体M1388

4.5 Phagemid载体系列91

4.6 酵母质粒载体94

4.7 人和动物病毒载体95

4.7.1 猴病毒40（SV40）96

4.7.2 牛乳头瘤病毒（BPV）98

4.7.3 RNA肿瘤病毒99

4.7.4 腺病毒（ADV）101

4.7.6 痘苗病毒（VCV）102

4.7.5 单纯疱疹病毒（HSV）102

4.8 植物病毒载体103

第5章杆状病毒载体及其表达系统105

5.1 杆状病毒的生物学105

5.1.1 杆状病毒的分类与基本结构105

5.1.2 杆状病毒的生活史105

5.1.3 杆状病毒的体外复制系统107

5.2 杆状病毒的分子生物学107

5.2.1 杆状病毒的基因组结构107

5.2.2 杆状病毒的基因概述107

5.3 杆状病毒基因的表达与调控111

5.3.2 早期基因的启动子结构112

5.3.3 迟晚期基因启动子及高效表达调控机制112

5.3.1 极早期基因的反式调控112

5.3.4 杆状病毒增强子的顺式调控113

5.3.5 杆状病毒重叠RNA的调控113

5.4 杆状病毒表达系统评价114

5.4.1 杆状病毒表达系统的优越性114

5.4.2 杆状病毒表达系统的缺点115

5.4.3 影响靶基因在昆虫细胞中表达的因素116

5.5 杆状病毒克隆表达的经典策略116

5.6 杆状病毒载体116

5.6.1 多角体基因转移载体118

5.6.2 p10基因转移载体122

5.6.3 其它基因构建的转移载体126

5.6.4 双基因转移载体129

5.6.5 多基因转移载体133

5.6.6 以绿色荧光蛋白基因作标记构建的转移载体133

5.7.1 β-半乳糖苷酶基因(β.galactosidase gene,简称LacZ)137

5.7 杆状病毒表达系统中阳性重组病毒的筛选137

5.7.2 斑点杂交和原位杂交138

5.7.3 PCR技术139

5.7.4 胸腺核苷激酶基因（thymldine kinase gene, 简称tk）139

5.7.5 新霉素抗性基因（neomycin resistance gene,简称neo）140

5.7.6 细胞凋亡抑制基因（p35 基因）143

5.8 杆状病毒克隆表达的新策略144

5.8.1 高频重组策略(线型化技术)144

5.8.2 转座子介导的重组策略(Bac to Bac系统)145

5.8.3 体外酶促定位重组策略152

5.8.4 酵母YAC介导的重组策略152

第6章放射性同位素和DNA的标记155

6.1 放射性同位素的基本知识155

6.2 放射性同位素的衰变156

6.2.1 放射性同位素的衰变类型156

6.2.2 分子生物学中常用的放射性同位素157

6.3 放射性同位素的衰变定律158

6.4 放射性的探测与测量159

6.4.1 盖革计数管(Geiger counter tuber)159

6.4.2 闪烁计数器161

6.4.3 放射自显像164

6.5 DNA的放射性同位素标记165

6.5.1 外切法标记DNA的3′平头末端165

6.5.2 填充法(fill-in)标记DNA的3′平头末端166

6.5.3 外切法标记DNA3′不等末端(recessed end)167

6.5.4 末端转移法标记dsDNA的3′末端167

6.5.5 dsDNA的5′-磷酸末端标记167

6.5.6 dsDNA的5′-OH末端标记168

6.5.7 限制性消化法制备探针168

6.5.8 缺刻转移法制备探针169

6.5.9 随机引物标记法制备探针169

6.5.10 DNA全链的逆转录酶标记法170

6.5.11 DNA大片段的链终止法标记171

6.5.12 RNA标记171

6.6 放射性同位素实验室的安全及防护171

第7章DNA的物理图谱173

7.1 概述173

7.2 部分消化法174

7.3 双酶消化法176

7.4 顺序消化法179

7.5 交叉消化法181

7.6 末端标记法181

7.7 内切外切混合消化法181

7.8 分子杂交法185

7.9 Southern十字杂交法188

7.10 组建DNA物理图谱的三三规则189

第8章分子杂交195

8.1 分子杂交的原理195

8.2 Soutbern blot198

8.2.1 DNA片段的转移198

8.2.2 Southern薄膜杂交199

8.3 凝胶薄膜杂交200

8.3.1 凝胶薄膜的制备200

8.3.2 杂交201

8.4 原位杂交(Hybridization in situ)201

8.4.1 菌落生长202

8.4.2 DNA的释放与固定202

8.4.3 杂交202

8.5 斑点杂交(Dot blot)203

8.6 Northern blot203

8.7 Western blot204

8.8 Southern十字吸附杂交法(Cross blot)205

第9章DNA的序列测定210

9.1 引言210

9.2 DNA序列测定的ddNTP链终止法211

9.2.1 ddNTP链终止法原理211

9.2.2 DNA链终止法测定系统212

9.2.3 DNA大片段序列的测定战略232

9.3 DNA序列测定的 加减法240

9.3.1 DNA的不同步合成240

9.3.2 “减”系统241

9.3.3 “加”系统241

9.4 DNA序列测定的化学直读法242

9.5 DNA序列的激光测定法244

10.1 PCR原理247

第10章多聚酶链反应(PCR)247

10.2 PCR的扩增过程249

10.2.1 用于PCR扩增的Taq DNA聚合酶249

10.2.2 用于PCR扩增的引物250

10.2.3 用于PCR扩增的dNTP252

10.2.4 PCR缓冲液中的Mg2+ 浓度253

10.2.5 DNA样品253

10.2.6 矿物油253

10.2.7 循环次数253

10.2.8 PCR反应的温度和时间254

10.2.9 扩增产物的大小和结构255

10.3 PCR的类型256

10.3.1 套组PCR(Nested PCR)256

10.3.2 表达PCR(Expession PCR)258

10.3.3 锅柄PCR(Panhandl PCR)260

10.3.4 行军PCR(Walking PCR)261

10.3.6 不对称PCR(Asymmetric PCR)262

10.3.5 反向PCR(Inverse PCR)262

10.3.7 序列PCR(Sequencing PCR)263

10.3.8 等位特异性PCR（Allele-Specific Amplification,ASA）263

10.3.9 Alu PCR264

10.3.10 差异PCR(Differential PCR)264

10.4 超长DNA片段的PCR扩增264

10.4.1 扩增超长DNA片段的要点265

10.4.2 扩增超长DNA片段的PCR策略267

10.5 反转录PCR(RT- PCR)270

10.5.1 连续RT- PCR(两阶段单管式)270

10.5.2 长距离RT- PCR(两阶段双管式)271

10.5.3 一步RT- PCR272

11.1.1 DNA的提取274

第11章分子克隆274

11.1 基因的分离与合成274

11.1.2 从原核生物分离纯化目的基因280

11.1.3 从真核生物分离纯化目的基因280

11.2 外源基因与载体DNA的连接反应原理285

11.3 外源基因与载体DNA的连接反应291

11.3.1 引言291

11.3.2 连接反应的类型294

11.3.3 cDNA与载体的连接反应299

11.4 重组DNA分子导入原核细胞300

11.4.1 感受态细胞(Competance Cells)302

11.4.2 转化程序303

11.4.3 阳性重组菌落的筛选303

11.5 重组DNA分子导入真核细胞306

12.1 基因工程的表达系统309

第12章外源基因的表达与调控309

12.2 外源基因在转录起始水平的调控310

12.2.1 RNA聚合酶(RNA polymrase,反式作用正调控因子)311

12.2.2 启动子(Promoter,顺式作用正调控元件)313

12.2.3 基因工程常用启动子315

12.2.4 操纵元(Operon,顺式作用正调控元件)319

12.2.5 增强子(Enhancer,顺式作用正调控元件)321

12.2.6 减弱子(Debancer,顺式作用负调控元件)322

12.3 外源基因在转录终止水平上的调控323

12.3.1 终止子(Terminator,顺式作用负调控元件)323

12.3.2 衰减子(Attenuator,顺式作用负调控元件)324

12.4 外源基因在转录后的调控327

12.5 外源基因表达在翻译水平上的调控327

12.5.1 偶联翻译与非偶联翻译327

12.5.2 原核mRNA的Shine-Dalgarno序列(SD序列,顺式作用正调控元件)328

12.5.3 原核钥匙蛋白(Key protein,反式作用负调控因子)329

12.5.4 真核mRNA的Kozak序列(顺式作用正调控元件)329

12.5.5 真核mRNA翻译的起始因子(反式作用正调控因子)330

12.5.6 反意RNA(Antisence RNA,简称at-RNA)332

12.6 高效表达外源基因的措施333

12.6.1 最适SD序列333

12.6.2 融合蛋白的表达及载体阅读框架的修饰334

12.6.3 减轻缩主细胞的代谢负荷,提高外源基因的表达水平337

附录340

一、常用数据和参数340

二、某些基因组DNA的限制片段和大小（bp）348

三、遗传密码351

四、常用培养基和抗菌素352

五、常用溶液和缓冲液355

参考文献360