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第一章常用蛋白质实验技术1

一、硫酸铵分级沉淀1

二、相分配法除核酸2

（一）试剂和贮备溶液3

（二）从大量蛋白质中除去核酸3

（三）从核蛋白中提纯蛋白质4

三、离子交换层析5

（一）离子交换树脂的处理5

（二）离子交换层析操作5

四、蛋白质浓度测定8

（一）光吸收法8

（二）双缩脲法8

（三）劳瑞（Lowry）法9

（四）劳瑞微量法9

五、蛋白质溶液的浓缩10

六、稳定蛋白质的方法11

七、聚丙烯酰胺凝胶电泳12

（一）凝胶夹层的组装12

（二）带浓缩胶的SDS-凝胶电泳14

（三）尿素-SDS-梯度凝胶电泳16

（四）凝胶染色18

（五）荧光显影18

第二章常用核酸实验技术20

一、核酸浓度及纯度测定20

（一）分光光度法20

（二）溴乙锭荧光法20

二、核酸的制备22

（一）大肠杆菌DNA的制备22

（二）果蝇DNA的制备23

（三）果蝇全RNA的制备25

（四）果蝇rRNA的制备26

三、DNA的纯化27

（一）DEAE-纤维素层析28

（二）HAP吸附层析29

四、SephadexG-50凝胶过滤29

（一）SephadexG-50处理30

（二）常规柱层析法30

（三）旋转柱层析法30

五、DNA凝胶电泳31

（一）琼脂糖凝胶电泳32

（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳35

（三）凝胶染色与摄影36

（四）从凝胶中洗脱DNA37

六、核酸浓缩38

（一）乙醇沉淀38

（二）丁醇抽提39

七、核酸沉淀40

（一）乙醇沉淀40

（二）三氯乙酸沉淀40

（三）聚乙二醇沉淀41

八、DNA的贮存42

九、三磷酸核苷溶液的配制42

十、核苷酸纸层析48

第三章载体-宿主体系44

一、质粒44

（一）质粒载体举例44

（二）外源DNA克隆53

二、λ噬菌体58

（一）溶菌生长途径59

（二）溶源生长途径60

（三）λ载体的构建61

（四）载体选择61

（五）λ载体图谱62

三、科斯体81

四、单股DNA噬菌体85

第四章细菌和噬菌体繁殖与贮存89

一、单菌落分离89

（一）划线法89

（二）稀释法90

（三）涂布法90

二、细菌的培养与贮存91

（一）细菌培养91

（二）细菌贮存91

三、λ噬菌体的纯化与增殖92

（一）宿主菌培养92

（二）噬菌斑形成92

（三）噬菌斑选取93

（四）噬菌体制备93

四、培养基与抗生素95

（一）液体培养基95

（二）固体培养基97

（三）抗生素97

第五章载体DNA的制备99

一、λ噬菌体的大量制备99

（一）感染法99

（二）诱导法100

（三）λ噬菌体的纯化101

（四）λDNA的提纯104

二、质粒DNA的大量制备105

（一）细菌培养与质粒扩增105

（二）菌体收集与溶菌106

（三）闭环DNA的提纯108

（四）RNA的去除109

第六章用于基因操作的酶110

一、限制性内切核酸酶110

二、甲基化酶116

（一）dam甲基化酶116

（二）dcm甲基化酶117

（三）EcoR工甲基化酶（大肠杆菌）简介118

三、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ119

（一）DNA缺口转移反应119

（二）DNA聚合酶工（大肠杆菌）简介121

四、Klenow聚合酶123

（一）双链DNA 3′-凹端的修补123

（二）DNA末端的快速标记124

（三）Klenow酶（大肠杆菌）简介126

五、T 4 DNA聚合酶127

（一）DNA末端的快速标记127

（二）置换合成128

（三）T4DNA聚合酶（T4感染的大肠杆菌）简介130

六、T4多核苷酸激酶131

（一）DNA 5 ′-突端的标记131

（二）DNA平端或5′-凹端的标记132

（三）合成接头的标记133

（四）DNA 5′-突端的标记（交换反应）134

（五）T4多核苷酸激酶（T4感染的大肠杆菌）简介135

七、以RNA为模板的DNA聚合酶136

（一）脱氧寡核苷酸引物的制备137

（二）杂交探针的制备138

（三）以RNA为模板的DNA聚合酶（反转录酶）简介139

八、碱性磷酸酯酶140

（一）DNA 5′-末端磷酸的去除141

（二）碱性磷酸酯酶（BAP和CIP）简介142

九、核酸酶Bal31142

（一）DNA限制位点作图143

（二）DNA片段克隆143

（三）核酸酶Bal31简介144

十、核酸酶S1145

十一、绿豆核酸酶145

十二、核糖核酸酶146

十三、脱氧核糖核酸酶Ⅰ146

十四、外切核酸酶Ⅶ147

十五、外切核酸酶Ⅲ147

十六、λ外切核酸酶149

十七、多聚（A）聚合酶149

十八、T 4 DNA连接酶150

十九、末端脱氧核苷酸转移酶151

二十、T 4 RNA连接酶151

第七章真核mRNA的制备与分析152

一、细胞质RNA的制备153

二、Poly （A）+RNA的纯化155

三、细胞全RNA的制备156

（一）胍-热酚法156

（二）胍-氯化铯法157

四、RNA凝胶电泳分析158

（一）乙二醛-二甲亚砜系统158

（二）甲醛系统159

（三）氢氧化甲汞系统161

五、RNA的SI酶定位法162

第八章cDNA的合成与克隆165

一、合成cDNA的技术要点165

（一）cDNA第一链的合成165

（二）cDNA第二链的合成166

（三）发夹环的切割166

二、克隆双链cDNA的方法167

（一）用匀聚物接尾168

（二）用合成接头接尾169

（三）克隆mRNA·cDNA170

（四）用寡核苷酸引发cDNA第二链的合成171

（五）用质粒引发cDNA两条链的合成171

三、克隆cDNA的谋略172

（一）丰富mRNA的运用172

（二）稀有mRNA的运用173

（三）按分子长度富集mRNA174

（四）合成寡聚脱氧核苷酸的运用174

（五）“对比杂交”的运用175

（六）免疫沉淀法的运用175

四、合成和克隆cDNA的操作176

（一）匀聚物接尾法176

（二）双接头法184

第九章重组DNA导入宿主菌188

一、用质粒DNA转化大肠杆菌188

（一）用氯化钙提高转化率188

（二）用氯化钙和氯化铷提高转化率189

（三）用多种盐提高转化率190

二、λ噬菌体DNA的体外包装192

（一）λ噬菌体溶源的贮存与检验193

（二）包装方法工194

（三）包装方法Ⅱ196

第十章基因文库的组建199

一、用λ载体组建文库199

（一）载体DNA的制备201

（二）真核DNA片段的制备204

（三）连接与包装208

（四）文库扩增212

二、用科斯体组建基因文库213

（一）用去末端磷酸的科斯体克隆213

（二）用去磷粘端不同的科斯体克隆217

（三）科斯体文库的筛选、扩增与贮存220

第十一章重组克隆体鉴别222

一、原位杂交222

（一）菌落杂交筛选223

（二）λ噬菌斑杂交筛选226

（三）核酸分子杂交228

二、cDNA克隆体的杂交鉴别231

（一）膜上杂交法231

（二）溶胞物转译法238

（三）蛙卵母细胞转译法240

三、DNA序列的重组鉴别242

（一）原理242

（二）实验材料245

（三）W3110r-m+（p3）的转化246

（四）用λ文库感染W3110r-m+（p3）（πVX）246

（五）噬菌体校正基因的遗传学检验246

（六）πVX系统的检验247

（七）πVX系统的使用249

第十二章重组克隆体分析250

一、克隆体DNA的快速分离250

（一）少量质粒DNA的快速分离250

（二）少量λ噬菌体DNA的快速分离253

二、限制酶切点定位254

（一）依次消化法255

（二）部分消化法256

三、DNA序列定位258

（一）SOUTHERN转移259

（二）膜上杂交260

四、 DNA片段次级克隆262

（一）粘端DNA片段次级克隆62

（二）合成接头的安装263

（三）补齐5′-突端263

（四）切除3′-突端264

（五）合成接头或衔接物安装265

（六）限制位点的恢复和组建266

（七）快速克隆268

第十三章克隆基因的表达载体269

一、启动子269

（一）λ噬菌体PL启动子270

（二）其它启动子272

二、核糖体结合位点272

三、真核基因的表达型载体273

（一）表达非融合蛋白质的载体273

（二）表达融合蛋白质的载体280

四、基因表达的放大286

五、基因量的扩增287

六、总结287

附录Ⅰ常用生物化学技术289

玻璃和塑料器皿的处理289

器皿表面的硅化处理289

有机试剂处理289

液体培养基290

凝胶培养基291

浓缩培养基291

λ噬菌体用培养基291

抗生素溶液292

贮备溶液292

常用溶液293

酶液配制294

限制酶消化用缓冲液295

常用电泳缓冲液296

常用凝胶电泳加样缓冲液296

32P-标记核苷酸处理297

基因操作中的核酸纯化297

放射自显影298

核酸放射性的定量299

质粒聚合物的制备300

Maxam-Gilbert序列测定法300

附录Ⅱ常用数据303

商品酸碱浓度和密度303

限制酶消化反应条件307

pBR322DNA限制片段长度（bp）307

λ噬菌体DNA限制片段长度（bp）308

RNA凝胶电泳分子量标记物309

三磷酸核苷和脱氧核苷物化常数310

蛋白水解酶使用和贮存条件310

附录Ⅲ常用菌株311

参考文献313