《微生物遗传学实验技术》

前言页1

第一部分革兰氏阴性菌遗传实验技术1

Ⅰ．大肠杆菌、沙门氏菌等1

1-1 用转座子Tn10诱变分离大肠杆菌营养缺陷型1

1-2 转座子Tn5诱变柠檬酸细菌5

1-3 转座子Tn1721对硫细菌的诱变7

1-4 Mini-Tn 10插入突变库的建立10

1-5 把Mini-Tn10放到目的基因近旁13

1-6 鼠伤寒沙门氏菌转座子MudJ插入突变体的分离16

1-7 鼠伤寒沙门氏菌嘌呤生物合成途径的调节突变体的分离19

1-8 重组缺陷菌株的构建24

1-9 局部诱变法27

1-10 四环素敏感株的正选择（Bochner选择法）30

1-11 鼠伤寒沙门氏菌基因的Hfr杂交定位32

1-12 鼠伤寒沙门氏菌DNA部分串性重复株的构建37

1-13 用部分染色体DNA重复菌株进行基因定位44

1-14 三点杂交试验47

1-15 大肠杆菌基因缺失的转移50

1-16 鼠伤寒沙门氏菌基因向大肠杆菌的转移52

1-17 静止基因激活突变体的分离55

1-18 插入突变体的缺失定位59

1-19 大肠杆菌基因的体内克隆61

1-20 宋内氏志贺氏菌（Shigella sonnei）Ⅰ相大质粒的Tn5标记和诱动转移66

1-21 宋内氏志贺氏菌（Shigella sonnei）Ⅰ相大质粒的Tn501标记和共转移69

1-22 广泛宿主范围的基因转移72

1-23 电穿孔法在细菌质粒DNA转化中的应用78

Ⅱ．根癌农杆菌83

1-24 Ti质粒及其他大质粒的检测83

1-25 Ti质粒的大量制备和纯化90

1-26 根癌农杆菌Ti质粒的接合转移和转化94

1-27 三亲菌株接合99

1-28 植物表达载体及表达框架的构建101

1-29 中间载体向根癌农杆菌的转移和转化108

1-30 用含有外源基因的根癌农杆菌转化植物组织110

1-31 外源基因在转基因植株中的表达113

第二部分革兰氏阳性菌遗传实验技术123

Ⅰ．枯草杆菌123

2-1 枯草杆菌噬菌体普遍性转导123

2-2 枯草杆菌原生质体的转化127

2-3 枯草杆菌质粒DNA的提取130

2-4 枯草杆菌感受态细胞的转化134

2-5 枯草杆菌启动子的克隆137

2-6 枯草杆菌中利用质粒克隆基因140

2-7 利用ρ11噬菌体进行基因克隆144

2-8 枯草杆菌特异转导噬菌体的构建149

Ⅱ．棒状杆菌157

2-9 氨基酸缺陷型的筛选157

2-10 产氨基酸抗反馈调节突变株的选育161

2-11 棒状杆菌质粒的提取164

2-12 质粒DNA转化棒状杆菌原生质体168

第三部分链霉菌遗传实验技术173

3-1 链霉菌总DNA的分离173

3-2 链霉菌质粒DNA的分离177

3-3 链霉菌原生质体的制备和再生182

3-4 质粒DNA转化链霉菌原生质体189

3-5 利用质粒作为载体的链霉菌基因克隆196

3-6 链霉菌原生质体融合204

Ⅰ．酵母菌的遗传分析209

4-1 酵母菌的遗传分析和基因定位209

第四部分酵母菌遗传实验技术209

Ⅱ．酵母菌质粒载体的构建214

4-2 酿酒酵母质粒DNA的分离214

4-3 基因克隆载体的构建218

4-4 酵母表达载体的构建224

4-5 酵母分泌载体的构建228

Ⅲ．酵母菌转化234

4-6 酵母菌原生质体转化法234

4-7 酵母菌完整细胞转化法237

4-8 酵母菌转化子的鉴定239

Ⅳ．酵母菌外源基因的克隆和表达244

4-9 酵母菌染色体DNA片段的分离244

4-10 酵母菌基因文库的构建248

4-11 转化子中目的基因的检测253

4-12 TRP5基因在酵母受体中的表达255

Ⅴ．酵母菌原生质体融合259

4-13 酵母菌原生质体的制备和再生259

4-14 PEG诱导酵母菌原生质体融合262

4-15 电场诱导酵母菌原生质体融合264

4-16 细胞核转入原生质体的操作技术266

4-17 微小（mini）原生质体融合法268

4-18 线粒体转入原生质体的操作技术271

4-19 酵母菌原生质体的融合子鉴定方法273

Ⅵ．酵母细胞质遗传实验技术277

4-20 酵母线粒体突变株[rho0,rho-,ani？,及mir-]的分离277

4-21 线粒体突变株的鉴定标准285

4-22 线粒体基因重组288

4-23 酵母菌杀伤因子(killer factor)的分离和鉴定297

第五部分丝状真菌遗传实验技术303

5-1 纤维素酶抗阻遏突变体的选育303

5-2 玉米黑粉菌线粒体DNA的分离和纯化308

5-3 麦角菌的原生质体诱变和营养缺陷型选择311

5-4 草菇的原生质体诱变和营养缺陷型选择317

5-5 曲霉属内原生质体融合后遗传重组320

5-6 外源基因导入丝状真菌的一般方法329

5-7 粟胡麻斑病菌Hib-2菌株的原生质体转化335

5-8 潮霉素B抗药性基因hph在洋葱灰霉病中的转化340

第六部分在λ噬菌体中构建基因库345

6-1 λ噬菌体的生长和制备345

6-2 噬菌体DNA的大量制备和提纯349

6-3 在噬菌体中构建基因组DNA库352

6-4 包装的文库效价测定及涂平板培养357

6-5 λ噬菌体包装抽提物的制备360

第七部分M13克隆367

7-1 M13噬菌体原液的制备和测定367

7-2 M13噬菌体DNA的制备370

7-3 克隆到M13载体和感受态细胞的转染376

7-4 M13重组子的分析和鉴定380

第八部分体外诱变385

8-1 克隆DNA的体外定位诱变——含尿嘧啶单链DNA模板法385

8-2 克隆DNA的体外定位诱变——脱氧硫代核苷酸保护法392

8-3 聚合酶链反应（PCR）——DNA体外酶促扩增法398

第九部分附录405

9-1 常用培养基405

9-2 溶液和缓冲液的配制410

9-3 限制酶417

9-4 DNA片段在琼脂糖和丙烯酰胺凝胶中有效分离范围422

9-5 DNA分子量标记（kb）423

9-6 抗生素423

9-7 一些常用单位425

9-8 常用仪器426