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第1章杆状病毒概论1

1.1 杆状病毒的结构2

1.2 杆状病毒的感染周期5

1.2.1 对虫体的感染5

1.2.2 离体复制7

1.3 杆状病毒的基因组成11

1.3.1 物理图谱12

1.3.2 已经鉴定的杆状病毒基因14

1.3.3 同源区30

1.4.1 基因表达的时序性31

1.4.2 转录的调节32

1.5 杆状病毒DNA的复制39

1.5.1 DNA复制原点39

1.4 杆状病毒基因表达的调控39

1.5.2 DNA复制的方式41

1.6 杆状病毒感染对宿主基因表达的影响42

第2章利用杆状病毒作为基因表达载体的原理43

2.1 杆状病毒作为基因表达载体的条件44

2.2 受体系统—昆虫细胞系、幼虫和蛹45

2.3 构建重组杆状病毒的技术原理和方法47

2.4 杆状病毒介导外源基因表达的特点50

第3章杆状病毒转移载体54

3.1 什么是杆状病毒转移载体?54

3.2 杆状病毒转移载体的构建57

3.3 杆状病毒转移载体的类型60

3.3.1 单基因转移载体61

3.3.2 多基因转移载体99

4.1 转移载体的选择107

第4章构建重组病毒的策略107

4.2 亲本病毒的选择109

4.2.1 与polh位点型转移载体匹配使用的亲本病毒110

4.2.2 与pl0位点型转移载体匹配使用的亲本病毒112

4.2.3 转称载体与亲本病毒的匹配113

4.2.4 穿梭载体114

4.3 重组介体115

第5章昆虫细胞培养121

5.1 昆虫细胞系121

5.2 昆虫细胞培养基123

5.2.1 增补血清培养基123

5.2.2 无血清培养基126

5.2.3 低血清培养基127

5.2.4 培养基的配制128

5.3.1 细胞培养的条件和操作规则131

5.3 昆虫细胞的传代培养131

5.3.2 单层培养134

5.3.3 悬浮培养135

5.3.4 由有血清培养转入无血清培养的过渡136

5.4 昆虫细胞的冻存和复苏137

5.4.1 昆虫细胞的液氮冻存和复苏137

5.4.2 昆虫细胞的短期低温保存139

第6章杆状病毒在昆虫培养细胞中的增殖、滴定和纯化141

6.1 杆状病毒对培养细胞的感染141

6.1.1 影响杆状病毒感染培养细胞的因素142

6.1.2 单层培养细胞的感染144

6.1.3 悬浮培养细胞的感染146

6.2 杆状病毒的滴定146

6.2.1 空斑测定147

6.2.2 TCID50测定150

6.3 杆状病毒毒种的纯化152

6.3.1 空斑纯化153

6.3.2 终点稀释纯化154

6.4 杆状病毒毒种的扩增156

6.5 BVs的大量制备158

第7章外源基因与转移载体的嵌合160

7.1 外源基因的分离和修饰160

7.1.1 外源目的基因的分离161

7.1.2 外源基因片段的修饰163

7.2 转移载体的准备165

7.3 外源基因与转移载体的连接167

7.4 嵌合转移载体的筛选和鉴定168

7.4.1 细菌的转化168

7.4.2 嵌合转移载体的检测170

7.5 嵌合转移载体的扩增和纯化174

7.5.1 细菌的大量培养和裂解175

7.5.2 嵌合转移载体DNA的纯化177

第8章重组病毒的构建181

8.1 感染性亲本病毒DNA的准备181

8.1.1 从BVs提取DNA181

8.1.2 从PIBs提取DNA184

8.1.3 亲本病毒DNA的线化185

8.2 嵌合转移载体和亲本病毒DNA对昆虫细胞的共转染186

8.2.1 磷酸钙—DNA共沉淀转染法186

8.2.2 Lipofectin介导转染法187

8.3 将嵌合转移载体和亲本病毒DNA导入酵母细胞188

8.4 将供体质粒和亲本病毒DNA导入大肠杆菌细胞192

8.5 重组病毒的筛选和纯化194

8.5.1 重组病毒的筛选194

8.5.2 重组病毒的纯化195

9.1 重组病毒基因组的分析198

9.1.1 从受感染细胞中提取病毒DNA198

第9章重组病毒的分析和鉴定198

9.1.2 病毒DNA的限制性内切酶分析200

9.1.3 病毒DNA的Southern杂交分析202

9.2 外源基因表达产物分析207

9.2.1 病毒感染细胞蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳208

9.2.2 病毒感染细胞蛋白质的放射性标记212

9.2.3 病毒感染细胞蛋白质的免疫学分析214

9.2.4 外源基因产物表达的时程分析224

9.3 外源基因表达产物转译后加工的分析225

9.3.1 糖基化分析225

9.3.2 磷酸化分析228

9.3.3 十六脂酸化和十四脂酸化分析229

9.4.1 从病毒感染细胞中提取RNA230

9.4 外源基因转录的分析230

9.4.2 病毒RNA的Northern杂交分析232

第10章重组蛋白的扩大生产236

10.1 利用培养细胞生产重组蛋白237

10.1.1 利用悬浮培养细胞生产重组蛋白237

10.1.2 利用生物反应器生产重组蛋白239

10.2 利用昆虫虫体生产重组蛋白241

10.2.1 鳞翅目昆虫的发育241

10.2.2 鳞翅目昆虫的饲养242

10.2.3 病毒感染246

10.2.4 重组蛋白的收集248

10.2.5 从虫体中分离纯化多角体250

附录 常用贮备液、缓冲液和培养基252

参考文献256