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第一节 分子生物学的理论和技术是肝炎病毒研究的重要手段1

一、丙肝病毒和戊肝病毒的发现从基因水平上取得突破1

第一章 肝炎病毒的分子生物学概论1

二、分子生物学技术是肝炎病毒病原学检测的重要手段2

三、HBV DNA转染细胞系的建立为HBV的研究提供了体外繁殖体系3

第二节 分子生物学技术是病毒性肝炎发病机制的研究手段4

一、分子杂交技术原位检测肝炎病毒的核酸成分4

二、HBV DNA原位表达与HBcAg表达方式及其与病理改变的关系4

三、转基因动物是研究HBV等肝炎病毒致病机制的合适的模型4

一、HBV DNA复制是研究逆转录过程的一个很好的模型5

二、HBV DNA复制过程是研究转录物剪切加工机制的模型5

第三节 肝炎病毒的分子生物学研究可丰富分子生物学的理论5

三、HBV DNA的研究也是基因表达调控的一个重要手段6

第四节 用分子生物学技术探索抗肝炎病毒治疗的新途径6

一、分泌抗病毒物质的抗肝炎病毒基因治疗7

二、利用肝炎病毒的反式调节机制探讨抗肝炎病毒治疗的新方法7

三、反义技术抗肝炎病毒治疗方法8

第五节 肝炎病毒分子生物学内容9

一、肝炎病毒的基因结构和功能9

二、肝炎病毒基因表达和调控9

三、抗肝炎病毒新方法的探讨9

第二章 甲型肝炎病毒的分子生物学11

第一节 HAV基因结构11

一、5′非翻译区14

三、3′非翻译区15

第二节 HAV基因组编码产物15

二、编码区15

一、P1区16

二、P2区16

三、P3区16

第三节 HAV的复制17

一、HAV体外增殖17

二、HAV在体内的生活周期17

一、HAV基因组核酸变异18

二、HAV氨基酸序列变异18

第四节 HAV变异及分型18

三、HAV分型19

第五节 HAV抗原结构19

第六节 HAV减毒与细胞培养适应化的分子基础20

一、HAV野毒株与减毒株核苷酸比较20

二、2B和2C区基因突变21

三、5′-NTR对HAV体外生长的影响22

第七节 HAV疫苗的研究进展22

一、HAV灭活疫苗22

二、HAV减毒活疫苗23

三、基因工程疫苗23

第一节 HBV基因组25

一、顺向重复序列25

第三章 乙肝病毒基因的结构与功能25

二、S基因区29

三、C基因区30

四、P基因区31

五、X基因区31

第二节 HBV的复制31

一、HBV进入肝细胞31

二、HBV细胞内移行32

三、超螺旋双链HBV DNA的形成32

四、HBV DNA 前基因组的合成与装配32

六、HBV颗粒的装配与释放33

五、HBV DNA双链的形成33

第三节 HBV DNA的转录34

第四节 HBV结构蛋白37

一、包膜蛋白37

二、核心区蛋白39

三、HBV DNA多聚酶蛋白41

四、HBV的X蛋白42

第四章 丙肝病毒的分子生物学44

第一节 HCV基因的克隆化44

一、HCV是一种RNA病毒44

二、5-1-1片段的克隆45

三、HCV基因组克隆化的意义46

二、中国河北株与美、日株一级结构的比较47

一、丙肝病毒基因的一级结构47

第二节 丙肝病毒的基因结构47

三、中国丙型肝炎病毒河北流行株和上海流行株核脊酸序列的比较55

四、中国丙型肝炎病毒基因组克隆的方法57

第三节 HCV基因组变异及分型58

一、HCV 基因组分型的基础59

二、HCV基因组分型的方法59

三、HCV基因组分型的意义62

第四节 丙肝病毒蛋白的翻译63

一、HCV蛋白编码的基因结构64

二、核糖体与HCV 5′-NTR结合的方式65

三、HCV病毒蛋白的裂解产物66

四、HCV病毒多蛋白的裂解酶NS367

第五节 丙肝病毒感染的分子诊断68

一、HCV基因组扩增技术68

二、重组HCV抗原69

三、人工合成HCV抗原69

四、第一代抗-HCV检测方法70

五、第二代抗-HCV检测方法71

六、抗-HCV lgM的检测72

七、HCV核酸和蛋白的原位表达73

第五章 丁型肝炎病毒的分子生物学77

第一节 HDV的结构特性77

第二节 HDV的基因组和抗基因组78

一、HDV基因组的一级结构的发现78

二、HDV抗基因组RNA88

第三节 HDV的复制90

一、研究HDV基因组复制的实验系统91

二、HDV RNA 复制的代谢需要92

三、亚基因组mRNA92

四、翻译92

五、嗜肝DNA病毒在HDV基因组复制中的作用92

六、HDAg在HDV复制中的作用93

七、自身裂解95

八、自连98

九、HDV（复制）对HBV的影响98

二、两种蛋白的结构区及意义99

一、HDAg的一般特性99

第四节 HDV的蛋白质99

三、HDAg’的发现及特性102

四、28kDa的发现103

第五节HDV的分子生物学内容在诊断、治疗及预防等中的应用103

一、诊断上的应用103

二、治疗上的应用104

三、预防上的应用105

四、其它的应用105

第六章 戊型肝炎病毒的分子生物学110

第一节 HEV基因片段的克隆化110

一、原始材料110

三、HEV cDNA克隆的结果111

二、HEV cDNA克隆化实验流程111

四、HEV cDNA ET1.1成功的意义112

第二节 HEV基因组的结构113

一、HEV核苷酸的一级结构113

二、HEV cDNA全序列克隆策略116

三、不同株的一级序列比较117

四、戊肝病毒基因组与其它肝炎病毒基因组的比较120

五、HEV RNA的二级结构121

第三节 HEV 基因组表达研究122

一、HEV RNA 开放读框分析122

二、翻译方式123

一、HEV蛋白在克隆载体中的表达124

第四节 HEV基因重组表达与突变124

三、HEV抗原的表位124

二、HEV病毒蛋白融合基因的表达125

三、HEV基因组的变异与突变126

第五节 HEV的生活周期与体外培养127

一、HEV的生活周期127

二、HEV的细胞培养128

第六节 HEV的分子免疫学129

一、HEV病毒抗原129

二、HEV病毒蛋白的抗原决定簇129

三、HEV抗原在肝脏中的表达130

四、HEV表达人B细胞抗原表位*131

二、GBVs和HGV的基因构成及相应特性134

第七章 庚型肝炎病毒和GB病毒的分子生物学134

一、概况134

三、GBVs和HGV的结构蛋白137

第八章 乙肝病毒DNA转染细胞系的建立和应用141

第一节 HBV DNA转染细胞系的建立141

一、HBV DNA口的基因141

二、靶细胞的选择143

三、基因转移方法146

第二节 HBV DNA转染细胞系复制和表达的特点146

一、HBV DNA转染细胞系中HBV DNA的存在状态147

二、HBV DNA 转染细胞系中HBV DNA复制特点148

三、HBV DNA 转染细胞中的转录产物149

四、HBV蛋白的表达151

五、转染细胞中HBV DNA表达调控153

六、HBV颗粒的装配155

第三节 乙肝病毒基因组转染细胞系的应用156

一、HBV结构基因的表达156

二、HBV DNA调控研究158

三、HBV DNA突变研究160

四、HBV致病机制研究160

五、HBV感染与肝细胞癌的关系161

六、HBV DNA的转染在HDV研究中的应用162

第四节 转染细胞系在抗HBV药物研究中的应用163

一、病毒基因组复制163

二、病毒的转录164

三、蛋白的表达165

四、药物结构和抗HBV活性关系166

第九章 乙肝病毒的基因突变研究169

第一节 人工突变研究方法169

一、直接的缺失与插入突变169

二、系列缺失突变体构建169

三、人工合成方法170

四、PCR扩增法171

五、寡核苷酸定点诱变171

六、盒式突变173

一、突变体的构建174

第二节 直接重复序列的突变174

二、DR区突变的意义175

第三节 S ORF区基因突变176

一、前S1区突变176

二、前S2基因突变179

三、S基因突变180

第四节 C ORF区基因突变182

一、前C区突变182

二、C区突变183

第五节 P ORF和X ORF的突变183

一、R ORF的突变183

二、X ORF的突变184

一、S1核酸酶作用186

第十章 乙肝病毒复制和表达的调控186

第一节 基因调控的研究方法186

二、引物延伸实验187

三、基因突变法188

四、体外转录系统188

五、报道基因技术189

六、异种启动子表达实验190

七、尾随序列的置换与突变190

第二节 HBV基因调节的结构基础190

一、增强子序列190

二、HBV基因的启动子191

二、前基因组RNA转位与HBV DNA复制196

一、HBV DNAP突变与HBV DNA复制196

第三节 HBV DNA复制的调节196

三、HDV基因共转染对HBV复制的影响197

四、影响HBV DNA复制的细胞因子197

第四节 HBV DNA 转录物的剪切与调节198

一、HBV DNA转录物的种类和功能198

二、HBV DNA转录物剪切现象的发现199

三、HBV DNA转录物剪切机制*199

四、HBV DNA转录物的剪切特点200

第十一章 乙肝病毒与细胞因子203

第一节 影响HBV DNA表达调控的细胞因子203

一、HBV感染的免疫应答203

二、细胞因子的应答205

三、转录调节因子的应答208

第二节 干扰素与乙肝病毒208

一、HBV感染导致IFN系统的改变*209

二、干扰素对HBV复制与表达的影响209

三、HBV DNA的复制和表达对IFN的影响211

第三节 白细胞介素-2与乙肝病毒214

一、IL-2抗病毒作用的发现214

二、IL-2的抗乙肝病毒作用214

三、IL-2抗HBV作用的机制216

四、IL-2转基因表达抗病毒基因治疗的优势217

一、病因学219

第一节 肝炎病毒致肝细胞癌的证据219

第十二章 肝炎病毒与肝细胞癌219

二、流行病学220

三、动物模型和转基因动物222

四、转染细胞的模型222

五、肝炎病毒与癌基因的激活223

第二节 HBV DNA整合与HCC223

一、HBV DNA在肝细胞基因中的整合224

二、HBV DNA整合与HCC间的相互关系226

三、HBV DNA整合区的细胞基因重排226

四、乙型肝炎病毒致原发性肝癌模式229

二、X抗原对癌基因的激活230

一、X基因ORF的结构和作用230

第三节 HBV DNA X基因与HCC230

三、X基因研究的意义231

第四节 癌基因与HCC231

一、抗癌基因P53与肝细胞癌232

二、癌基因与肝细胞癌234

第五节 HCV和HCC236

一、原发性肝癌的抗-HCV检测237

第十三章 乙肝病毒蛋白质的基因工程表达239

第一节 HBV蛋白基因工程表达的条件239

一、表达细胞宿主239

三、HBV DNA基因片段241

二、表达载体241

第二节 原核细胞表达系统242

第三节 酵母菌表达系统242

常用的酵母克隆载体242

启动子的选择243

第四节 哺乳动物细胞表达系统243

一、表达的策略244

二、小蛋白的表达244

三、中蛋白的表达245

四、大蛋白的表达245

第五节 非包膜蛋白的基因工程表达246

二、多聚酶的表达及HBxAg的表达247

一、核心基因的表达247

第十四章 乙肝病毒转基因小鼠250

第一节 转基因动物的发展250

一、早期的转基因动物251

二、转基因动物中基因的表达251

三、外源基因的表达对转基因动物的影响252

第二节 转基因动物的建立方法252

一、外源基因的准备253

二、生殖细胞的准备253

三、外源基因导入受精卵的方法253

五、转基因动物的鉴定254

四、受体动物的准备及转导受精卵的植入254

第三节 转基因动物的应用255

一、肿瘤研究255

二、免疫学研究256

三、动物品种的改良257

四、基因表达的调节和控制257

五、生物工厂258

第四节 乙肝病毒转基因小鼠258

一、乙肝病毒概况259

二、乙肝病毒转基因小鼠的建立260

三、病毒基因表达的调控260

四、病毒基因组的复制263

五、病毒蛋白的合成263

七、重排序列的不稳定性264

六、转基因动物中的HBV致病性264

第十五章 肝炎病毒基因组的PCR扩增267

第一节 PCR技术的原理267

一、PCR技术的理论根据*267

二、PCR技术的基本过程268

三、PCR技术的影响因素268

四、PCR技术的类型270

第二节 几种新型的PCR技术271

一、定量PCR技术271

二、原位PCR技术271

三、SISPA PCR技术273

一、标本的倍比稀释法274

第三节 HCV RNA定量PCR技术274

二、竞争性逆转录PCR技术275

三、放射性核素掺入法276

四、HCV RNA定量检测的应用277

第四节 PCR技术在乙肝病毒研究中的应用278

一、检测微量HBV DNA278

二、抗病毒疗效的评价278

三、用于HBsAg亚型的研究279

四、血液及血制品安全性的研究279

五、鉴定HBsAg阴性的HBV感染者280

一、基因治疗的策略283

第一节 基因治疗概述283

第十六章 抗肝炎病毒的基因治疗283

二、基因治疗的条件284

三、基因治疗的操作步骤285

四、影响基因治疗的因素286

五、病毒性肝炎基因治疗的整体构想287

第二节 细胞内免疫抗病毒基因治疗288

一、细胞因子转基因表达288

二、抗病毒蛋白的转基因表达290

三、病毒特异性抗体转基因表达291

四、反式调节机制抗病毒基因治疗291

五、反义技术抗病毒基因治疗294

一、细胞自杀机制设计思路295

第三节 细胞自杀机制的抗病毒基因治疗295

二、病毒主导性酶药物预施疗法296

三、白喉毒素的转基因表达297

四、细胞程序化死亡机制298

五、细胞自杀机制设计的应用298

第十七章 抗肝炎病毒的反义技术301

第一节 反义技术的概念301

一、反义技术的定义301

二、原核细胞中的反义分子302

三、真核细胞中的反义分子302

第二节 反义分子的种类和来源304

一、反义分子的种类304

二、反义分子的来源308

第三节 反义技术的原理和应用309

一、反义技术的原理309

二、反义技术的应用311

第四节 反义技术抗肝炎病毒的作用靶位313

一、甲肝病毒基因组位点313

二、乙肝病毒基因组位点313

三、丙肝病毒基因组位点314

四、丁肝病毒基因组位点314

五、戊型肝炎病毒基因组位点314

第十八章 抗肝炎病毒的寡核苷酸317

二、修饰的ODN318

一、n-ODN318

第一节 寡聚核苷酸的种类318

三、ODN与其它反应基团的结合319

一、反义寡核苷酸的作用靶分子319

第三节 反义寡核苷酸的作用机制319

二、反义寡核苷酸的作用类型321

第二节 反义寡核苷酸的药代动力学323

一、一般原理323

二、定量分析方法324

三、体外资料324

四、体内资料325

第四节 寡核苷酸的合成326

一、反义寡核苷酸人工合成的发展326

五、药物毒性326

二、核苷酸合成的策略327

三、核酸小片段的化学合成327

四、核酸小片段的酶促合成法330

第十九章 抗肝炎病毒的核酶技术332

第一节 核酶概述332

一、核酶的发现332

二、核酶的基本结构333

三、核酶裂解反应条件337

四、核酶催化的酶学性质338

五、核酶RNA的来源339

一、靶链的选择340

第二节 核酶的分子设计340

二、裂解位点341

三、侧翼序列342

四、活性中心化学修饰343

五、载体序列343

六、启示子序列344

七、顺式和反式核酶345

八、二级结构345

第三节 抗肝炎病毒的应用345

一、抗HAV RNA 核酶技术346

二、抗HBV核酶技术346

三、抗HDV核酶技术347

索引349