《表1 引物信息：金刚藤颗粒对急性盆腔炎模型大鼠NLRP3炎症小体通路及免疫功能的影响》

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《金刚藤颗粒对急性盆腔炎模型大鼠NLRP3炎症小体通路及免疫功能的影响》

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灌胃15 d后，次日清晨处死大鼠，打开腹腔，腹主动脉采血，取血3 mL，室温避光静置30 min，3 000 r/min离心15 min，分离血清置于-20℃冰箱中保存待测。1) ELISA检测大鼠血清IL-1β，IL-18水平。按照试剂盒说明书进行。2）大鼠病理形态学观察。打开腹腔，摘取双侧子宫，肉眼观察子宫色泽、弹性、化脓及周围组织是否粘连。观察完毕后将大鼠部分子宫组织置于-80℃冰箱保存，部分组织于4%多聚甲醛溶液中固定，子宫组织切成5μm的切片，苏木精-伊红（HE）进行染色，显微镜下观察子宫组织的病理形态。3）实时定量PCR检测NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1 mRNA表达水平。取冻存的各组织标本并按照Trizol试剂盒（Fermenas公司）说明书提取总RNA，将RNA反转录为cDNA并以其为模板进行实时定量PCR检测。反应体系为25 mL:SYBR GreenⅠqPCR Master Mix 12 mL，上下游引物各1 mL，cDNA模板1 mL，ddH2O 10 mL。其中引物合成见表1，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反应程序：95℃10 min；95℃15 s；48℃30 s；72℃30 s，共40个循环。反应结束后收集数据，并对所得数据Ct值进行分析，以GADPH为内参基因，采用2-ΔΔCt算法计算NLRP3、ASC、IL-1、Caspase-1 mRNA的相对表达量。引物信息见表1。4) Western blotting检测子宫组织NL-RP3、ASC、IL-1β、Caspase-1蛋白表达水平：取出液氮中冻存的子宫组织剪切50～100 mg制备组织匀浆，蛋白裂解液反应30 min，提取总蛋白；BCA试剂盒测定蛋白浓度，SDS变性蛋白；SDS-PAGE电泳跑胶，蛋白上样量为20μg，电泳结束后切除目的条带凝胶，目的蛋白凝胶转移到PVDF膜上，4℃进行转膜，转膜反应1 h，后用TBST清洗；5%脱脂奶封闭1 h，TBST洗3×5 min，一抗（NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1抗体，稀释倍数1∶1 000) 4℃过夜，TBST洗3×5 min；IgG二抗（稀释倍数1∶5 000）室温孵育1h，TBST洗3×5 min；ECL显色液显色，凝胶成像仪观察蛋白表达情况，Image J进行目的条带的灰度光密度分析，以β-Actin为内参。