《表1 FBXO22缺失对3周龄小鼠存活率的影响 (n)》

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《Fbxo22基因敲除小鼠模型的建立和表型研究》

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注:“Expected”表示根据孟德尔遗传定律计算的理论数量；“Observed”表示观察到的数量。（1）P=0.000，与Fbxo22-/-组的Expected比较。

用CRISPR-Cas9方法，设计靶向针对Fbxo22的3号外显子的sgRNA，靶向序列为GGAAGAGTGTCGTG GCCAT，其5'端有1个由3个碱基组成的原间区相关基序（protospacer associated motif，PAM）CCT，该序列对目的基因的识别具有重要作用[18-19]（图1A）。在sg RNA引导下，Cas9识别目的基因并切割，产生3号外显子的4种突变体，分别为缺失1 bp、缺失8 bp、插入1 bp、插入6 bp，所获得的F1子代为含这些突变的杂合子，基因型有4种。因为突变前后碱基数目变化不大，小鼠基因型通过测序鉴定，Fbxo22+/-为套峰，其余为单峰（图1B）。F1代小鼠再同胞交配获得F2代小鼠，理论上F2代小鼠中25%为Fbxo22-/-纯合子小鼠。但是，我们对3周龄F2代小鼠的基因型进行分析，发现在近100只小鼠中，仅有4只Fbxo22-/-?小鼠，而Fbxo22+/+和Fbxo22+/-小鼠的数量分别为28和66只，Fbxo22-/-小鼠的数量明显偏少，不符合孟德尔遗传定律（表1）。这提示Fbxo22缺失可能引起小鼠胚胎致死或出生后早期死亡，进而导致3周龄的Fbxo22-/-小鼠得率显著降低。为了检测Fbxo22的敲除效果，我们运用Western blotting技术检测Fbxo22-/-和Fbxo22+/+成年小鼠的心、肝、肾、脑、肺、胃和脾中FBXO22的蛋白水平。结果显示，在Fbxo22+/+小鼠的各个组织中可检测到FBXO22蛋白，并且在脑组织中呈现高表达，而Fbxo22-/-小鼠的各个组织中均未检测到FBXO22蛋白，提示Fbxo22基本敲除（图2）。