《表1 引物序列：Genistein通过JAK2/STAT3信号通路抑制小鼠视网膜新生血管的形成》

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《Genistein通过JAK2/STAT3信号通路抑制小鼠视网膜新生血管的形成》

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各组取P17小鼠4只，8眼行real-time PCR检测JAK2 mRNA和STAT3 mRNA表达，利用生工RNA提取试剂盒提取小鼠视网膜总RNA后，按Revert AidTMFirst Strand c DNA Synthesis Kit说明书逆转录条件:11μl RNA（1μg），随机引物（0.2μg/ml） 1μl，65℃孵育5 min；加入4μl 5×Buffer，3μl d NTP（10 mmol/L），1μl RNA酶抑制剂（20 U/μl）和1μl逆转录酶（20 U/μl），25℃孵育10 min、42℃孵育1 h、72℃孵育15 min，完成RNA逆转录为c DNA的过程。以c DNA为模板，分别对JAK2和STAT3进行PCR。引物序列见表1。加入PCR反应液，94℃预变性10 min，活化Tag酶；94℃15 s，60℃60 s，45个循环结束。反应结束后通过熔解曲线检测，确认扩增的特异性，根据各组组织中β-actin、JAK2和STAT3mRNA的Ct值，以2-ΔΔCt表示各组组织中JAK2和STAT3 mRNA的相对表达。1.2.6 Western blot法检测JAK2和STAT3蛋白在小鼠视网膜的表达各组取P17小鼠3只，6眼行Western blot法检测，用裂解液裂解小鼠视网膜，置于Eppendorf管中，超声匀浆，10 000g，4℃离心10min，取上清，蛋白定量。加入等体积的2×SDS buffer（Tris-Cl 100 mmol/L，DTT 200 mmol/L，甘油20%，溴酚蓝0.2%，SDS 4%），95℃煮沸5 min，迅速冰浴，10 000g，4℃离心10 min，收集上清。蛋白经SDS-PAGE电泳法分离（JAK2 8%的分离胶，STAT315%的分离胶），电转印法将电泳条带转移到PVDF膜上，5%BSA溶液，4℃封闭3 h；分别加入兔抗鼠JAK2单克隆抗体或兔抗鼠STAT3单克隆抗体，4℃过夜孵育，洗涤，再加入抗兔Ig G二抗，孵育，洗涤；ECL底物化学发光，显影，定影，扫描。以β-actin为内参。根据各组组织中β-actin、JAK2和STAT3蛋白印迹测定的光密度值，以JAK2/β-actin的比值和STAT3/β-actin比值表示各组组织中JAK2和STAT3蛋白的相对表达。