《表1 针对工业异构酶的部分改造研究》

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《异构酶在生物制造中的研究进展》

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学者们针对前述各类异构酶展开了大量研究，主要目的在于改造它们从而获得更好的催化性能和热稳定性（如表1总结），下面列举有代表性的案例。对CE酶的改造包括酶活力的提升、热稳定性增强、副产物降低等几个方面。对Ruminococcus albus CE的研究表明保守残基R52、H243、E246、W249、W304、E308和H374影响酶活力，其丙氨酸突变体均完全失活，F114和W303也对活性有很大影响。晶体结构研究表明，H243、W249、H374、H377和M378位于活性中心入口处，R52和F114在活性中心的底部，2个组氨酸H374和H243作为广义酸碱执行催化反应；活性口袋的整体疏水性较强，确保底物不被水解[46]。对CSCE的研究表明，双点突变E161D/N365P酶活性半衰期延长了4倍，最适反应温度由80℃上升到87.5℃，对乳糖的催化效率kcat/Km上升了29%[47]。通过4轮基于随机突变的定向进化筛选，SHEN等[48]又将CSCE的酶活性和催化效率分别提升了2.8和3倍，突变体酶有5个位点改变（R5M/I52V/A12S/K328I/F231L）。令人意外的是突变体酶不产依匹乳糖，使得乳果糖产率上升到76%。由于R5、A12、K328和F231都是位于CSCE酶表面的残基，因此它们对产物选择性的影响尚无法阐述。而I52距离活性中心仍然较远，因而需要晶体结构研究进一步揭示这些残基对催化产生的影响。对L-AI酶的改造包括酶活力提升、最适温度和p H改造等，G.thermonitrificans L-AI的突变体F280 N/C450S/N475K具有更高的转换数kcat值，达到6 245 min-1，催化效率kcat/Km达到4.7 L/（mmol·min）[49]。对MPI酶的改造包括定点突变获得R142 N突变体，其kcat值达到81 063s-1，是野生型的1.6倍[50]。总结以上研究可得出结论，异构酶普遍缺乏高通量的突变体筛选方法，产物检测依赖高效液相色谱，因此常使用基于理性设计的定点突变方法以减少样品数量。