《表4 适应性进化抗生素筛选浓度表》

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《适应性进化和改造质粒稳定性促进枯草芽孢杆菌合成N-乙酰神经氨酸》

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适应性进化对于提高微生物在相关培养基上的生长和抗应变能力很重要。通常，实验室中常用的定向进化方法为分批培养-连续传代，这种方法成本比较低并且可以通过深孔板等更小培养体积的设备进行大规模培养，物理化学因素也比较可控。因此在这里我们选择分批培养-连续传代培养方法。在之前的研究中，通过对2个关键前体N-乙酰氨基葡萄糖（Glc NAc）和磷酸烯醇式丙酮酸的供应途径进行模块途径工程以及平衡Neu Ac的生物合成和细胞生长，Neu Ac产量达到2.18 g/L[10]。为了进一步提高Neu Ac产量且平衡细胞生长，我们将生物传感器与适应性进化结合，在进化过程中不断提高抗生素浓度，使得高产细胞形成生长优势，从而富集得到高产菌株。由2.1小节可知，Neu Ac-biosensor对抗性基因的调控效果在菌株BS3中效果较显著，因此以带有单抗性和双抗性的BS3菌株为出发菌株，抗生素的筛选浓度梯度如表4所示，对其进行适应性进化，孔板发酵每隔24 h以10%的接种量进行取样及传代，5次传代之后结束发酵。前期研究发现，在进化过程中，小部分细胞在没有指定代谢物产生的情况下也能存活[19]，这种“逃逸”是由于永久选择敏感性的突变引起的[20-21]，因此我们使用了双抗性标记筛选来减少这种假阳性者的存活。经过5轮进化筛选之后，我们对3种抗性筛选平板均选取了15个单菌落进行了发酵验证，通过HPLC方法测定Neu Ac浓度后发现壮观霉素和红霉素筛选分别有4个和5个菌落较出发菌株产量有提高，而双抗性筛选则有8个菌落较出发菌株产量有所提高，不同菌株的产量如图2所示。按照上述假阳性率测定方法得到单抗性筛选的假阳性率为73.3%（壮观霉素）、66.7%（红霉素），而双抗性筛选的假阳性率则为46.7%。通过单抗性标记与双抗性标记筛选的对比实验发现，双重选择能够有效减少假阳性菌株，再次体现了双抗性筛选策略的优势，同时得到1株产量为（3.16±0.19） g/L的菌株BS3C，较出发菌株产量提高了31.7%。