《表4 混合鱼肉样品中各鱼类成分熔解温度值》

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《多重实时聚合酶链式反应熔解曲线法同步鉴别蓝鳍金枪鱼、裸盖鱼、异鳞蛇鲭》

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配制蓝鳍金枪鱼、裸盖鱼、异鳞蛇鲭的混合肉样（各物种源性成分含量比例相同，物种组合见表4），提取各样品D N A，以提取的D N A为模板进行多重real-time PCR扩增，并分析熔解曲线，再次验证所建多重real-time PCR体系的特异性，同时确定各物种成分熔解温度（Tm）分布范围。分析各样品熔解曲线图，结果如图2、3所示，所检样品的熔解曲线峰位置、峰个数均与样品的物种源性成分组成相对应，均没有非特异性峰出现的现象，进一步表明建立的多重real-time PCR体系具有很好的特异性。3次重复实验并计算各物种源性成分的Tm值，计算结果见表4。实验并统计不同引物浓度体系、不同模板浓度中3种鱼类的Tm值分布情况，由统计结果可知3种鱼类源性成分的熔解温度分布段分别为蓝鳍金枪鱼源性成分Tm值（74.98±0.60）℃、裸盖鱼源性成分Tm值（78.65±0.71）℃、异鳞蛇鲭源性成分Tm值（82.38±0.25）℃，各物种源性成分的Tm值均有偏移，异鳞蛇鲭源性成分的Tm值漂移范围最小，为0.5℃，裸盖鱼源性成分的Tm值漂移范围最大，为1.42℃，整体看来各物种源性成分的Tm值偏移跨度较小，表明所建方法稳定性较好；各物种源性成分Tm值范围之间相互不交叉，因此，分析所检测样品熔解曲线，根据谱图中溶解峰数和温度范围（即峰的位置）能准确判定所检样品中含有的物种。