《表2 引物配比及各组分添加量（总体积25μL)》

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《多重实时聚合酶链式反应熔解曲线法同步鉴别蓝鳍金枪鱼、裸盖鱼、异鳞蛇鲭》

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选取蓝鳍金枪鱼、裸盖鱼、异鳞蛇鲭的特异性引物，首先优化退火温度、循环数等扩增条件，已往文献报道多重PCR扩增过程中各引物对存在相互竞争的关系，引物浓度对多重real-time PCR能否扩增目标物种起重要作用，在多重PCR体系中调配合适的引物浓度能够有效避免个别物种漏检情况的发生[29]，据此设计系列不同浓度梯度的引物组合体系，根据各组合系统所产生的峰图高度调整不同物种引物浓度，以出现平滑、基本等高且特异的峰值图为标准，选定最优组合体系。如表2所示，采用25μL的PCR体系，其中SYBR Green酶体系预混液12.5μL，上下游引物（5μmol/L）各4.2μL（上下游引物为蓝鳍金枪鱼、裸盖鱼、异鳞蛇鲭特异性引物按比例混合组成），模板DNA 2μL，加无菌重蒸水补足至25μL。real-time PCR程序：95℃预变性5 min；95℃变性10 s，58℃退火和延伸共计45 s，重复35个循环；熔解峰图制作：95℃变性1 min，降温至70℃保持1 min，之后均匀速率（0.02℃/s）升温至95℃，并连续采集各温度下的荧光值；然后，60 s内降温至40℃。以温度为横坐标，荧光值对温度的一阶负导数为纵坐标，制作熔解峰值图。