《表2 SSR-PCR反应正交设计L16(45)》

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《木麻黄SSR-PCR反应体系的建立与优化》

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采用L16(45）正交设计对影响木麻黄SSR-PCR体系扩增效果的4个因素Taq酶（5 U·μL-1，Ta KaRa公司）、Mg2+(25 mmol·L-1，Ta Ka Ra公司）、d NTP(2.5 mmol·L-1each，Ta Ka Ra公司）和引物进行四因素四水平正交优化（见表2）。以荧光引物M26为试验引物，短枝木麻黄无性系A8 DNA为模板DNA，对照表1进行各项处理，每个处理重复3次。PCR体系采用10μL反应体系，每个处理加入1μL 20 ng·μL-1的DNA模板，1μL的10×PCR buffer(free Mg2+，Ta Ka Ra公司），Taq酶、Mg2+、d NTP和引物按照试验要求依次加入，不足部分用dd H2O补足。木麻黄最佳PCR反应体系筛选时的扩增程序为降落PCR:95℃预变性5 min，94℃变性30 s，52～62℃退火30 s，每个循环降0.5℃，72℃延伸1 min，20循环后94℃变性15 s，引物Tm预设值退火15 s，72℃延伸30 s，循环35次，72℃延伸10min，4℃保存；引物最佳退火温度筛选和最佳体系验证为常规PCR程序：95℃预变性5 min，94℃变性1 min，退火45 s，72℃延伸1 min，循环35次，72℃延伸10 min，4℃保存。在Long Gene A600 PCR仪（杭州朗基科学仪器有限公司）上进行扩增，PCR产物利用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，电压120 V，时间为30 min(BIO-RAD Powerpac Basic），利用凝胶成像仪（BIO-RAD Chemi Doc XRS）进行拍照分析，电泳结果根据何正文[27]的方法进行处理，主带清晰，杂带少，二聚体产物少为优，最优者计16分，依次递减，最差者计1分。所得结果利用正交设计助手3.1和SAS9.4进行直观分析和方差分析，以便获得木麻黄SSR-PCR最佳反应体系。