《表2 山核桃PCc KO在核桃体胚(SE)和再生植株(RP)中的阳性率统计(1)》

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《山核桃贝壳杉烯氧化酶基因CcKO的克隆和表达分析》

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（1）E1、E2和E3分别为不同继代次数的次生胚。E1，E2 and E3 are the secondary embryos with different times of subculture.

选取生长健壮的核桃体胚进行遗传转化（该体胚记为E0代体胚，E0表面产生的新体胚记为E1代体胚，以此类推），用制备好的CcKOpro∷GUS启动子表达载体的农杆菌菌液进行侵染，培养至E1、E2、E3代分别进行GUS染色。研究结果发现，GUS染液浸染8 h后部分转化体胚呈现明亮的蓝色，其中越靠近胚芽，染色越深（图3A），对照体胚无显色反应（图3E）。统计结果表明，E1代体胚GUS阳性率为30%，E2代体胚GUS阳性率为50%，E3代体胚GUS阳性率为70%（表2）。进一步对E3代中GUS染色呈蓝色的体胚进行PCR检测（图4A），样品获得2000 bp条带，与预期大小一致，统计PCR阳性率为100%。待GUS阳性体胚萌发成完整植株，进一步对再生植株进行PCR检测，条带大小为2 000 bp的株系确定为阳性植株（图4B），统计结果表明阳性率为75%。对已鉴定的转化植株茎叶进行GUS染色，结果发现:阳性植株叶片的小叶叶脉处呈现明显的蓝色，其中主叶脉最为明显（图3B），而对照植株叶片染色后无蓝色（图3F）。进一步对再生植株茎徒手切片横切面GUS染色后发现，转化的阳性植株茎横切面维管束部位显示明显的蓝色，而表皮、皮层和髓薄壁细胞蓝色较浅；进一步对茎纵切面进行染色，同样显示维管束部位为明显的蓝色，而表皮、皮层和髓薄壁细胞显色反应较弱（图3C、D）；对照植株茎横切面和纵切面染色后无蓝色（图3G、H）。因此，推测该山核桃CcKO基因主要定位在维管束中。