《表3 不同孵育温度的交联反应》

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《共价交联捕获聚酮合成中的酮基还原酶和酰基载体蛋白结构域的瞬时复合物》

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为了证实该交联策略的通用性，另构建了两个KR+ACP质粒，Pik（KR+ACP）1（来自苦霉素pikromycin合成途径，其所含KR为B2型）和Amp（KR+ACP）11（其所含KR为A2型）。采用与pET-28a-Amp（KR+ACP）2相同的构建策略，即将TEV限制性位点插入KR和ACP的柔性多肽之间，对KR域和ACP域进行共价束缚。在Pik（KR+ACP）1的第345位丝氨酸和Amp（KR+ACP）11第351位丝氨酸处引入半胱氨酸的突变，这2个丝氨酸分别是其KR域活性口袋中的催化残基，并将KR中其余无关的半胱氨酸突变为丝氨酸。蛋白表达纯化和后续交联反应操作与Amp（KR+ACP）2相似。