《表2.PknK pulldown-MS方法鉴定的PknK相互作用候选蛋白》

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《分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PknK的功能研究》

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在质谱分析筛选出的靶标蛋白中，我们挑选了PknA与Pkn K进行了体外pulldown实验验证。首先，我们构建了PknA的表达质粒pGEX-5x-pknA，并转化得到表达菌株。纯化的GST-PknA与PknK-His混合孵育，用GST-tag进行pulldown，收集洗脱液并进行Western blotting检测。结果显示，GST-PknA与PknK-His共孵育时，最终的洗脱液能够被His抗体检测到，即带有GST-tag的PknA能够与PknK结合，并使一同被洗脱下来的携带有His-tag的PknK被His抗体检测到；而GST与PknK-His共孵育时，最终的洗脱液不能被His抗体检测到，即单独表达的GST无法与PknK结合（图5-A）。同时，洗脱液中的GST-PknA及GST被GST抗体检测到，而PknK-His不能被检测到，说明实验系统是有效的（图5-B）。该实验证明，在体外条件下，Pkn K可以与PknA蛋白进行相互作用，所以PknK可能是通过与PknA等蛋白相互作用从而影响细菌的生长（图6）。