《表3 CAV-I和CAV-II标准品制备PCR反应程序》

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《犬腺病毒Ⅰ型和Ⅱ型Taq Man双重荧光定量PCR方法的建立》

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分别以CAV-I和CAV-II型病毒为模板，参照如下反应体系（表2，总体积25μL）和循环条件（表3）进行PCR扩增，以获得目的片段。将PCR目的片段胶回收纯化克隆至TOPO载体中，重组质粒转化至E.coli JM109感受态细胞，经菌液鉴定和测序，筛选阳性克隆，扩大培养后提取质粒；将提取的质粒用Qubit 3.0进行质粒浓度测定，并根据拷贝数计算公式计算拷贝数，然后进行10倍梯度稀释，获得8个梯度标准品（108～101copies/μL）。CAV-I型和CAV-II型各个梯度标准品按照1:1比例混匀，制备CAV-I和CAV-II混合标准品。