《表1 PCR引物序列：从Kiss1、GPR54 mRNA表达水平探讨过度瘦身对大鼠生殖功能的影响及左归丸的干预作用》

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《从Kiss1、GPR54 mRNA表达水平探讨过度瘦身对大鼠生殖功能的影响及左归丸的干预作用》

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大鼠采血后，迅速分离并摘取下丘脑组织，将其置入RNA保存液中，于-80℃冰箱冻存，用于荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）法进行mRNA的检测。具体方法：（1）抽提总RNA，测吸光度[D（260）]，并定量。（2）逆转录：(1）按下列顺序在200μL PCR管中加入下列反应物（体积为12μL):DEPC水（10-x）μL；随机引物/Oligo dT（50 p M/μL）2μL；RNA xμL（2μg）；（2）放置于PCR仪中，65℃处理5 min；（3）立即冰浴，高速（高于5 000 g）离心5 s；（4）按下列顺序在PCR管加入下列反应物（加入之后总体积为20μL):RNA酶抑制剂（50 U/μL)1μL；5×buffer 4μL；dNTP MIX（10 mmol/L）2μL；RevertAid M-MuLV RT（200 U/μL）1μL；（5）混匀后，25℃，5 min，42℃，60 min（对于GC含量比较高的样本，可以将温度提高到45℃）；（6）70℃，处理5 min；（7）高速（高于5 000 g）离心5 s。-20℃保存。（3）荧光定量PCR扩增：（1）序列与引物，序列参照Gene Bank数据库中各目的基因的序列。见表1。（2）PCR反应体系（10μL):H2O 1.5μL；2×SYBGEEN PCR mix-5μL；Primer（10 pM/μL）/Primer(10 pM/μL）1μL；Template（反转录产物，也即cDNA)2.5μL。（3）反应条件：95℃，2 min；95℃，5 s；60℃，10 s。45个循环。熔解曲线。实验结果说明：所有的数值先与内参做了△Ct，然后用第1个样品做相对含量（p)=2-△△Ct分析。