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第一章 生物大分子物质的制备1

第一节 材料的选择与处理1

一、有效成分的特性1

第一编 概论1

二、材料选择的一般原则2

三、材料的处理2

1．动物脏器2

2．植物组织3

3．微生物3

第二节 建立测定方法3

一、目的与要求3

二、测定方法4

1．光谱法4

2．电化学法4

2．组织捣碎器法5

3．超声波法5

第三节 细胞的破碎5

1．研磨法5

一、机械破碎5

4．压榨法6

5．冻融法6

二、溶胀和自溶6

1．溶胀6

2．自溶6

三、化学处理法6

四、酶法7

第四节 抽提7

一、抽提方法7

二、影响抽提有效成分的因子7

1．pH值7

3．蛋白酶或核酸酶8

2．溶剂的极性和离子强度8

4．温度9

5．搅拌9

6．氧化9

7．金属离子10

8．抽提液与抽提物的比例10

第五节 浓缩10

一、沉淀法10

二、吸附法10

三、超过滤法11

四、透析浓缩法11

五、减压蒸馏浓缩法12

六、冰冻干燥法12

第六节 纯化方案的设计原则13

一、纯化方案的选择13

二、纯化方案的评价13

第七节 有效成分的纯度和性质的分析16

第八节 实例17

一、制备高纯度的人转铁蛋白的快速方法17

二、叶绿体的提取与4.5SRNA的制备17

三、细菌质粒DNA的提取18

第二编 纯化方法19

第二章 沉淀法19

第一节 基本原理19

第二节 沉淀的类型及操作19

一、盐析法19

1．盐的分级沉淀20

2．盐析曲线的制作21

3．影响盐析的因子23

4．脱盐26

二、有机溶剂沉淀法27

三、蛋白质沉淀剂28

四、聚乙二醇沉淀作用29

3．重金属29

1．碱性蛋白质29

2．凝集素29

五、选择性沉淀法30

六、结晶30

第三节 实例31

一、脾磷酸二酯酶的纯化31

1．丙酮粉的制备31

2．第一次硫酸铵分级分离32

3．第二次硫酸铵分级分离32

4．丙酮分级分离32

第三章 吸附层析法34

第一节 吸附柱层析36

一、常用述语（对所有层析都适用）36

1．固定相36

6．外水体积37

8．基质体积37

7．内水体积37

3．操作容量37

5．洗脱体积37

4．床体积37

2．流动相37

9．膨胀度38

10．分配系数和迁移率38

二、基本原理38

三、吸附剂39

1．吸附剂的选择39

2．吸附剂的性质39

四、洗脱剂42

五、层析柱的制备及层析操作43

2．吸附剂的用量44

3．装柱44

1．层析柱44

4．上样和洗脱45

5．吸附剂的再生46

六、应用与实例46

1．应用46

2．实例47

第二节 薄层层析法49

一、具体操作及注意事项51

1．薄层板的制备51

2．点样54

3．展层54

4．显色57

二、实例62

第三节 聚酰胺薄膜层析法63

一、基本原理64

二、DNS-氨基酸的聚酰胺薄膜层析65

1．试剂及样品的制备66

2．展层剂与展层67

3．注意事项67

三、DABTH-氨基酸的薄层法在蛋白质顺序分析中的应用69

1．DABTH-氨基酸的制备71

2．DABITC在手工液相测定顺序法中的应用71

3．利用薄层法测定DABTH-氨基酸71

第四章 分配层析法—纸层析法75

第一节 基本原理75

第二节 影响Rf值的主要因素76

一、分离物的结构76

二、流动相（展层剂）77

1．性质77

2．组成77

3．pH值77

四、滤纸的性质78

三、温度78

1．滤纸的选择79

2．滤纸的处理79

第三节 应用79

一、氨基酸的定性分析79

1．样品制备和点样79

2．双向层析80

3．显色81

4．测Rf值81

二、氨基酸的定量分析81

1．比色法81

2．光密度法81

第五章 离子交换层析84

第一节 基本原理84

第二节 离子交换剂的分类及其性质87

1．疏水性离子交换剂88

一、分类88

2．亲水性离子交换剂90

二、性质95

1．颜色与形状95

2．交联度96

3．吸水量或膨胀度96

4．交换容量99

6．比重102

5．稳定性102

7．流速103

第三节 离子交换剂与缓冲液的选择106

一、离子交换剂的选择106

1．对阴、阳离子交换剂的选择106

2．对强、弱离子交换剂的选择107

3．对不同离子型交换剂的选择107

4．对不同基质离子交换剂的选择107

2．缓冲液离子强度和pH值的选择108

二、缓冲溶液的选择108

1．缓冲液组分的选择108

第四节 操作110

一、离子交换剂的处理、再生和转型110

二、分离物质的交换111

三、物质的洗脱与收集112

第五节 应用115

一、制备、纯化生物物质116

1．用强阳离子交换剂树脂732分离四种核苷酸116

2．用离子交换法从胰酶水解的肠粘膜液中提取肝素钠117

3．用DEAE-纤维素22层析法纯化解酚假单胞菌邻苯二酚-2、3-双加氧酶118

二、测定蛋白质的等电点119

第六章 凝胶过滤122

第一节 凝胶的分类及性质122

一、葡聚糖凝胶122

1．理化性质124

2．（稳定性）125

3．吸附性125

二、琼脂糖凝胶128

三、聚丙烯酰胺凝胶131

四、Sephacryl132

第二节 基本原理134

第三节 操作137

一、凝胶的选择和处理137

1．凝胶的选择137

2．凝胶用量的计算138

3．凝胶的处理138

二、凝胶柱的制备139

1．柱的选择139

1．加样141

三、加样、洗脱和测定141

3．凝胶柱的鉴定141

2．装柱141

2．洗脱144

四、凝胶柱的再生和处理146

1．再生146

2．脱水处理147

第四节 应用149

一、脱盐和浓缩149

二、分离提纯149

三、去热源物质150

四、测定分子量150

1．用凝胶柱层析制作测定蛋白质分子量的标准曲线的方法152

2．用葡聚糖凝胶薄板测定蛋白质分子量154

五、其它156

第七章 亲和层析159

第一节 基本原理160

第二节 操作163

一、基质的选择163

二、配体的选择164

1．对欲纯化的大分子物质具有较强的亲和力164

2．具有一个与基质共价结合的基团166

三、亲和吸附剂的制备166

1．活化166

2．偶联169

3．配体结合量的测定170

四、特异性的吸附171

五、大分子物质的分离174

六、亲和层析柱的再生176

第三节 提高吸附剂与大分子物质亲和力的途径177

一、在配体和基质之间引入“手臂（arms）177

1．原理177

2．吸附剂衍生物的制备178

三、配体与基质以最少的键连接179

二、增加配体取代的程度179

四、基质多孔性的影响180

五、其它183

第四节 应用183

一、分离纯化大分子物质183

1．纯化抗体、抗原及其复合物183

2．分离纯化糖蛋白185

3．分离巯基蛋白185

4．分离核酸185

5．其它185

二、研究酶的结构与功能188

一、多缓冲剂和多缓冲交换剂190

1．多缓冲剂190

第一节 基本原理190

第八章 聚焦层析190

2．多缓冲交换剂191

二、聚焦层析的原理192

1．pH梯度溶夜的形成193

2．蛋白质的行为193

3．聚焦效应194

一、选择多缓冲交换剂及相应的缓冲液196

第二节 操作196

二、多缓冲交换剂用量的选择197

三、多缓冲交换剂的处理200

四、样品的准备200

五、上样和洗脱201

六、分离后的样品中多缓冲剂的去除201

第三节 应用201

一、分离模型蛋白质202

1．分离鸡蛋白组分203

二、分离复杂的物质203

2．分离糜鹿肌肉匀浆液中的蛋白质204

3．鉴定铁氧（化）—还（原）蛋白—NADP+氧化还原酶的某些特性205

第九章 气相色谱208

第一节 基本原理210

一、常用述语210

1．载气210

2．担体210

3．固定液211

4．死时间、保留时间和校正保留时间211

5．死体积211

8．分离度212

二、原理212

6．滞甾因子212

7．基线212

第二节 气相色谱仪的构造213

一、气源、载气流速的控制和测量214

二、进样系统214

三、恒温室215

四、色谱柱215

1．柱的形状及分类215

2．担体216

3．固定液的分类及选择217

五、检定器221

1．热导池检定器221

4．色谱柱的制备221

2．氢火焰离子化检定器223

第三节 操作224

一、操作要点224

二、操作条件的选择224

1．载气流速224

2．几个峰重叠在一起225

4．色谱峰不规则225

3．分析时间过长225

三、故障的分析与排除225

1．分离不完全225

3．进样量和进样速度225

2．柱温225

第四节 定性和定量分析方法226

一、定性分析方法226

1．利用校正保留值定性226

2．利用“加入法”定性227

3．利用保留值与化合物结构之间的关系定性227

二、定量分析方法228

2．定量方法229

第五节 应用233

一、蛋白质和氨基酸的分析233

三、糖类的分析234

四、脂肪酸的分析234

二、核酸的分析234

五、农药的分析237

第十章 高效液相色谱239

第一节 基本原理239

第二节 应用242

一、定性和定量分析242

二、酶活性的测定244

三、蛋白质分子量的测定247

1．用反相HPLC分离核苷酸248

2．用高效液相离子交换色谱分离核糖核蛋白复合物248

四、分离纯化核酸和蛋白质248

3．用高效聚焦色谱分离几种碱性谷胱甘肽转移酶的同功酶249

五、附表251

第十一章 固定化的酶和微生物257

第一节 制备方法258

一、固定化酶258

1．载体结合法258

2．交联法264

3．包埋法264

二、固定化微生物265

第二节 制品的性质265

一、酶的相对活力265

二、活力曲线与最适pH268

三、稳定性272

四、米氏常数273

五、其它276

第三节 应用277

一、工业方面277

二、医学方面279

三、生化分析方面281

1．自动分析281

2．酶电极282

3．分析生物大分子物质的结构283

4．研究酶的功能和反应机理284

5．亲和层析284

四、应用实例285

1．固定化5′-磷酸二酯酶的制备方法（重氮法）285

3．固定化抗坏血酸氧化酶的制备方法（肽法）288

1．（校正因子的概念）288

2．固定化具有葡萄糖异构酶活性菌体的制备方法（交联法）288

第三编 鉴定方法290

第十二章 电泳法290

第一节 基本原理292

一、材料准备295

1．电泳槽295

第二节 纸电泳295

2．缓冲液的选择296

3．滤纸的选择和剪裁296

二、点样298

1．点样位置和形状298

2．点样量298

3．点样方法299

三、电泳299

四、烘干300

五、显色300

六、定量测定法300

第三节 聚丙烯酰胺凝胶电泳303

一、基本原理304

1．聚丙烯酰胺的合成306

2．分离效应310

1．不连续垂直柱状凝胶电泳313

二、操作313

2．不连续垂直板凝胶电泳326

3．连续的盘状凝胶电泳和垂直板凝脉电泳328

4．线性或阶梯式梯度的柱状及板状凝胶电泳332

5．双向电泳337

第四节 琼脂电泳340

一、基本原理340

二、操作340

1．缓冲液的配制340

2．琼脂糖凝胶板的制备340

3．加样341

4．电泳341

5．观察342

三、应用实例342

第五节 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳343

一、基本原理343

1．凝胶浓度的选择344

二、操作344

2．样品的制备345

3．电泳条件345

4．固定345

5．染色345

6．计算迁移率（Rf值）346

第六节 聚丙烯酰胺凝胶电聚焦346

一、基本原理347

二、两性电解质的理化性质348

1．缓冲性能强349

2．导电性能好349

3．分子量小349

4．紫外吸收值低349

5．一般与分离样品不起化学反应349

三、两性电解质的PH范围及用量的选择350

四、测定蛋白质等电点的操作351

1．凝胶配制351

2．加样353

3．聚焦353

4．固定与染色353

5．样品PH的测定353

6．蛋白质的洗脱355

7．等电点的测定356

第七节 印迹法（或转移电泳）356

一、基本原理357

二、操作及注意事项（以蛋白质为例）358

1．蛋白质的分离358

2．印迹358

3.鉴定359

1．分析和制备特异成分361

2．检测生物大分子物质之间的相互作用361

三、应用361

3．实例362

第十三章 免疫化学法365

第一节 抗体的性质、制备及纯化365

一、抗体的性质365

二、多克隆抗体的制备367

1．抗原367

2．免疫373

三、单克隆抗体的制备385

1．单克隆抗体产生的机理386

2．操作387

四、抗体的纯化389

1．硫酸铵分离法389

2．DEAE—纤维素层析法390

第二节 抗原与抗体的特异性反应391

5．SPA—Sepharose亲和层析法391

3．ConA—Sepharose4B柱层析法391

4．抗原—Sepharose亲和层析法391

一、同位素标记法392

1．同位素的选择392

2．标记操作393

3．鉴定抗原与抗体398

二、酶标记法400

1．酶制品400

三、荧光标记法401

2．标记操作401

1．标记402

2．游离荧光素的去除402

3．保存402

4．检测402

第三节 免疫扩散法402

一、基本原理402

1．操作403

二、双向免疫扩散法403

2．沉淀弧图谱的分析405

3．注意要点405

第四节 免疫电泳法406

一、试验材料的准备406

二、微量多槽免疫电泳409

1．基本原理409

2．操作409

3．沉淀弧的识别411

三、对流免疫电泳412

四、火箭免疫电泳413

1．基本原理413

2．操作413

五、交叉免疫电泳与亲和电泳416

第一节 基本原理420

第十四章 离心420

第四编 仪器及应用420

第二节 离心机的类型及主要构造423

一、制备离心机423

1．普通离心机424

2．高速离心机424

3．超速离心机425

二、分析离心机426

第三节 应用428

一、分离制备样品428

1．差速分级离心法428

2．区带离心法429

二、沉降系数的测定433

第十五章 分光光度法436

第一节 基本原理437

一、光谱437

二、物质结构与光谱的关系438

三、光吸收的基本规律439

第二节 分光光度计的结构及类型442

一、主要结构442

二、类型448

1．721型分光光度计448

2．可见光—紫外光分光光度计448

第三节 应用451

一、测定物质的含量451

二、测定pKa值458

三、分析物质的结构459

四、测定动力学常数461

附录463

一、常用数据463

1．常见蛋白质等电点参考值463

2．常见蛋白质分子量参考值466

3．一些核酸限制性内切酶裂解入DNA的位点及其数目469

4．待测溶液和选用滤光片的对应关系表474

5．颗粒目数与直径（微米）的关系474

6．重量单位换算表474

二、常用缓冲液的配制475

1．乙酸-乙酸钠缓冲液（pH3.6—5.8）475

2．磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（0.2mol/LpH5.8—8.0）476

3．Tris—盐酸缓冲液（0.05mol/LpH7.0—9.0）477

4．硼砂—硼酸缓冲液（0.2mol/L硼酸盐pH7.4—9.0）478

5．甘氨酸—氢氧化钠缓冲液（pH8.6—10.6）478

6．广泛缓冲液（pH2.6—12.0）479

7．巴比妥—盐酸缓冲液（pH6.8—9.6）480

8．柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液（pH2.6—7.6）481

9．柠檬酸—柠檬酸、钠缓冲液（pH3.0—6.2）482

10．氯化钾—氢氧化钠缓冲液（pH12.0—13.0）483

参考文献484