《表1 引物序列：不同分期骨关节炎关节液中相关降解酶的表达差异》

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《不同分期骨关节炎关节液中相关降解酶的表达差异》

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参考王维山等[16]PCR实验步骤进行，简述如下:（1）总RNA提取:参照mirVanaTM miRNA Isolation Kit操作说明提取总RNA，超微量紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度，选用A260/A280值1.8-2.1的RNA溶液，用于后续实验；（2）反转录合成c DNA:按照TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription Kit要求条件，将总RNA稀释，配置15μL反应体系，即5μL经过稀释的RNA样本、3μL目的基因引物及内参GAPDH、配置好的试剂盒中的混合液7μL，简单离心后放进PCR仪反应。反应条件为:16℃30 min，42℃30 min，85℃5 min；（3）实时荧光定量PCR:根据反应体系配置说明配备总反应液20μL，即Custom TaqMan?Small RNA AssAy（20×）1μL；TaqMan?2×Universal PCR Master Mix，No AmpErase UNG?10μL；product from RT reaction 1.33μL；Nuclease-free water 7.76μL。反应条件为:95℃10 min→95℃15 s→60℃1 min，共进行40个循环，其中每个样本设3个复孔。结果用软件Rotor-Gene real-time PCR analysis software进行分析，以2-??Ct表示每个mRNA的相对表达量，经过对数换算后作为统计分析数据，?Ct=CtmRNA-CtGAPDH。相关引物序列见表1。