《表1.实验所用菌株和质粒》

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《茎瘤固氮根瘤菌环二鸟苷酸代谢相关基因的功能鉴定》

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使用细菌基因组DNA提取试剂盒，提取过夜培养的ORS571总DNA，以此为模板使用目标片段上下游引物2412-up-F/R和2412-down-F/R（表2）进行PCR扩增，得到710 bp上游片段和680 bp下游片段。将扩增的上下游片段分别连接到pEASY载体上，涂布培养IPTG诱导平板，筛选白色菌落，并进行测序验证。将测序正确的含上游片段菌株以及含载体pCM351的菌株纯培养提取质粒，使用NEB酶Mfe I和Kpn I进行酶切胶回收，用T4连接酶将含有相同酶切位点的两者连接。将得到的p CM351::2412-up片段转入大肠杆菌感受态中，平板涂布过夜培养，挑取单菌落进行菌落PCR验证，将验证正确的阳性克隆子提取质粒，用同样方法将下游片段连接到PCM351::2412-up上，最后得到含有上下游片段的pCM351::2412-up-down质粒。