《表1 试验所用引物：与猪流行性腹泻病毒M蛋白互作的宿主蛋白的鉴定》

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《与猪流行性腹泻病毒M蛋白互作的宿主蛋白的鉴定》

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以实验室保存毒株PEDV DR13 RNA为模板，利用引物1和2（表1）进行RT-PCR扩增M基因，Eco RΙ和XhoΙ双酶切载体PCAGGS-HA，采用同源重组试剂，将M基因克隆于载体PCAGGS-HA，构建重组质粒PCAGGS-HA-M。以Vero细胞全基因组RNA为模板，利用引物3和引物4（表1）进行PCR扩增CDC42-flag（tag），PCR反应体系:RNA（约25 ng/μL）4μL，2?One step mix 25μL，One step mix2.5μL，上、下游引物（10μmol/L）各2μL，以ddH2O补足50μL。PCR反应条件:50°C 30 min；94°C3 min，94°C 30 s，58°C 30 s，72°C 30 s，35个循环；72°C 5 min。利用引物5和引物6（表1）进行PCR扩增eIF3L-flag（tag）基因，反应体系同上，PCR反应条件:50°C 30 min；94°C 3 min，94°C30 s，58°C 30 s，72°C 90 s，35个循环；72°C5 min。快切酶Eco RΙ（5 U/μL）和XhoΙ（5 U/μL）双酶切载体PCAGGS，利用同源重组试剂盒，将CDC42-flag（tag）、eIF3L-flag（tag）基因克隆于载体PCAGGS，构建重组质粒PCAGGS-CDC42-flag、PCAGGS-e IF3L-flag。将上述质粒转化至TOP10感受态细胞，进行酶切及测序验证。