《表1 莽草酸途径基因的改造对L-Phe生产的影响》

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《代谢工程优化大肠杆菌高效合成L-苯丙氨酸》

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莽草酸途径连接中心代谢途径和分支酸途径，是L-Phe合成途径的重要组成部分[16]。作为连接中心代谢途径与分支途径的中间通路，莽草酸途径的通畅对于平衡代谢通量分布，减少毒副产物（如莽草酸等）积累至关重要[17-18]。本研究通过对莽草酸途径中各反应酶的表达强度进行梯度优化，测试莽草酸途径中各基因的改造对L-Phe合成及菌体生长的影响。在PHE3-1的基础上，依次替换莽草酸途径各酶的启动子，从莽草酸途径后段向前逐步确定各酶最适活力，构建了表1菌株。摇瓶发酵结果如表1所示，其中PHE5-2（过表达5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶Aro A）产量为9.3 g/L，较PHE3-1(8.4 g/L）提高了10.56%；在此基础上，依次对其余酶的表达量进行了优化，最终仅有PHE8-2（过表达3-脱氢奎宁脱水酶Aro D）对产物合成产生了正向作用。PHE8-2的L-Phe产量达11.9 g/L，与PHE5-2相比提高了27.96%。推测改造后的正向菌株应对产量或生长有积极的影响。经过多轮优化筛选，最终确定在6种酶中，仅有5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶Aro A和3-脱氢奎宁脱水酶Aro D可以通过适度强化提高L-Phe产量且不影响菌体生长，其余酶的表达水平已达最佳，无需优化。