《表1 引物序列总表：家蚕核型多角体病毒Bm11基因对病毒基因转录及ODV病毒粒子包埋的影响》

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《家蚕核型多角体病毒Bm11基因对病毒基因转录及ODV病毒粒子包埋的影响》

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下划线代表引物酶切位点。

利用λ-Red重组系统，插入用于抗生素筛选的氯霉素乙酰转移酶基因（cat）破坏Bm11，构建敲除型BmNPV Bacmid[13]。以pKD3为模板，使用引物KO-F和KO-R（表1）扩增cat基因片段。2个引物分别含有与Bm11上游侧翼区同源的68 bp序列和与下游侧翼区同源的65 bp序列，同时引入终止密码子。将打靶片段用凝胶纯化回收，经过电转化使其进入大肠埃希菌BW25113细胞，并用3种不同的引物通过PCR引物组合分析证实cat基因的插入。提取鉴定正确的Bacmid，电转化到大肠埃希菌DH10H中产生DH10Bm11KO感受态细胞。为确定Bm11缺失是否对病毒感染有影响，构建Bm11敲除型和野生型重组BmNPV Bacmid。参照文献[14]构建pFB-PH-GFP供体质粒（含有多角体蛋白基因polh和绿色荧光蛋白基因gfp），并分别电转化到感受态细胞DH10Bm11KO或DH10BmBac中以产生Bm11敲除型Bacmid bBm11KO或阳性对照bBmPH-GFP。构建策略如图1所示。为构建修复型病毒，使用引物Bm11Re-F和Bm11Re-R从BmNPV基因组扩增Bm11基因和编码HA标签C-末端序列的737 bp片段。用EcoRⅠ/XbaⅠ酶切PCR产物并克隆到pFB-PH-GFP中以产生转座供体质粒。将转座供体质粒转染进入DH10Bm11KO细胞，产生Bm11恢复型病毒Bacmid bBm11HA-REP。用M13正向和反向引物通过PCR确认重组产物。