《表2 微量小鼠睾丸总RNA氧化前后miRNA以及外参的比例变化》

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《NaIO_4氧化–深度测序技术的优化用于检测微量RNA样品中小RNA 3′末端甲基化修饰》

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小鼠睾丸RNA中包含大量pi RNA（带3′末端甲基化）和mi RNA（不带3′末端甲基化），是测试我们优化后的Na IO4氧化方法效果的理想对象。我们分别用10 ng、50 ng和100 ng小鼠睾丸总RNA测试优化后的微量RNA氧化建库的效果，并在样品中加入外参（Spike in:6条合成的RNA，3条带有3′末端的甲基化修饰，另外3条不带修饰）。NaIO4氧化处理后直接乙醇沉淀回收，然后进行文库构建。10～100 ng总RNA在用优化后的氧化方法处理后建库，均得到了清晰的目的条带，其中10 ng的条带最弱（图5A），推测已接近现有方法的检测极限。深度测序结果表明，氧化前的小鼠睾丸小RNA主要由miRNA（长度为20～24 nt）和piRNA（长度为25～32 nt）组成，NaIO4氧化处理后，不带有3′末端2′-O-甲基修饰的RNA（miRNA）消失，带有3′末端2′-O-甲基修饰的RNA（piRNA）不受影响（图5B）。根据外参氧化前后的比例，不同RNA起始量的氧化样本对带3′末端2′-O-甲基修饰的外参的富集倍数均超过千倍（表2），说明10～100 ng总RNA的氧化都是充分的。