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第一篇 光学分析法1

第一章 比色分析法1

1.1 基本原理1

1.1.1 光是电磁波1

1.1.2 色光的互补2

1.1.3 基本定律2

1.1.3.1 朗伯定律3

1.1.3.2 比耳定律4

1.1.3.3 朗伯-比耳定律4

1.1.4 比色分析法常用符号及其意义4

1.1.5 运算公式6

1.2 比色分析的条件7

1.2.1 显色7

1.2.1.1 显色反应的类型7

1.2.1.2 显色剂的选择8

1.2.1.3 影响显色的因素9

1.2.2 入射光10

1.2.3 干扰物质与干扰的排除11

1.2.4 溶液的浓度11

1.3 比色分析定量方法12

1.3.1 标准系列法12

1.3.2 等色法(平衡法)12

1.3.3 消光-浓度工作曲线法12

1.3.4 差示法13

1.3.5 催化比色法14

1.3.6 比色滴定法14

1.4 光电比色计15

1.4.1 光电比色计的工作原理15

1.4.2 光电比色计的主要部件16

1.4.2.1 光源16

1.4.2.2 滤光片16

1.4.2.3 比色槽17

1.4.2.4 光电池18

1.4.2.5 检流计19

1.4.3 国产581-G型光电比色计21

1.5 比色分析的误差22

1.5.1 不符合朗伯--比耳定律22

1.5.2 实验条件不一致23

1.5.3 入射光强度不稳定或单色性太差23

1.5.4 读数误差24

第二章 分光光度法27

2.1 基本理论27

2.1.1 光谱的类型27

2.1.1.1 发射光谱27

2.1.1.2 吸收光谱27

2.1.2 吸收光谱曲线28

2.1.3 产生吸收光谱的机理29

2.1.4 发色团和助色团31

2.2 影响吸收光谱的几种因素32

2.2.1 温度33

2.2.2 溶剂34

2.2.2.1 对曲线细微结构的影响34

2.2.2.2 对n→π跃迁的影响35

2.2.2.3 对π→π跃迁的影响35

2.2.3 pH值37

2.2.4 溶液浓度38

2.2.5 狭缝宽度38

2.2.6 背景吸收39

2.3 定性分析39

2.3.1 定性鉴定39

2.3.2 纯度鉴定41

2.3.3 结构分析41

2.4 定量分析42

2.4.1 单一物质的定量分析42

2.4.2 混合样品的定量分析42

2.4.2.1 吸收光谱不重叠的混合物定量方法42

2.4.2.2 吸收光谱重叠的混合物定量方法42

2.4.3 差光谱分析43

2.4.4 消化系数计算法44

2.4.5 络合物组成的测定45

2.5 分光光度计45

2.5.1 分光光度计的一般构造46

2.5.2 分光光度计的主要部件47

2.5.2.1 光源47

2.5.2.2 单色器47

2.5.2.3 比色杯51

2.5.2.4 光电变换元件52

2.5.2.5 检测单元53

2.5.3 分光光度计的主要性能指标55

2.5.4 紫外分光光度计的进展55

2.5.4.1 双光束分光光度计55

2.5.4.2 双波长分光光度计56

2.5.4.3 紫外检测器56

第三章 荧光分析法58

3.1 前言58

3.2 荧光的产生61

3.3 荧光分析的根据--荧光强度63

3.4 荧光效率65

3.5 影响荧光强度的因素67

3.5.1 pH值对荧光的影响68

3.5.2 温度对荧光的影响69

3.5.3 溶剂对荧光的影响69

3.5.4 激发光对荧光的影响71

3.5.5 荧光污染的影响71

3.5.6 自吸收和内滤效应的影响71

3.5.7 稀样品溶液的影响73

3.5.7.1 氧化作用73

3.5.7.2 光分解73

3.5.7.3 表面吸附73

3.5.8 荧光熄灭的影响74

3.6 荧光分析的仪器75

3.6.1 光源75

3.6.2 滤光片和单色器77

3.6.3 样品池(盛液杯)79

3.6.4 检测器79

3.6.5 光电荧光计80

3.6.5.1 单光电池光电荧光计80

3.6.5.2 双光电池补偿式光电荧光计80

3.6.5.3 日本Shimadzu Kotaki UM型微量荧光计81

3.6.5.4 国产930型荧光光度计81

3.6.5.5 国产DF-01型数字显示式荧光测定仪82

3.6.6 荧光分光光度计83

3.7 荧光分析的常用方法84

3.8 荧光分析的应用--具体方法举例85

3.8.1 糖类的测定85

3.8.2 乙醛酸(二羟醋酸)的测定--血，(尿和细菌抽提液中乙醛酸的测定87

3.8.3 维生素A的测定88

3.8.4 硫胺素和抗硫胺素的测定89

3.8.5 维生素D的测定91

3.8.6 胆碱和乙酰胆碱的测定91

3.8.7 胆固醇和胆固醇酯的测定92

3.8.8 氢化可的松(皮质醇)及其他皮质类固醇的测定92

3.8.9 肾上腺素和去甲肾上腺素的测定93

3.8.10 谷氨酰胺和天冬酰胺的测定94

3.8.11 基于赖氨酸的含量对组蛋白的测定96

3.8.12 谷胱甘肽的测定96

3.8.13 组胺的测定97

3.8.14 组织中蛋白酶的测定97

3.8.15 组织蛋白酶B的测定98

3.8.16 β-葡萄苷酸酶的测定98

3.8.17 5′-核苷酸磷酸二酯酶的测定98

3.8.18 半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的测定99

3.8.19 核糖核酸酶的测定99

3.8.20 DNA和RNA的测定100

3.8.21 腺嘌呤及其衍生物的测定103

第二篇 层析法104

第一章 层析概论104

1.1 发展简史104

1.2 层析法中的一些术语105

1.3 层析法的分类106

1.3.1 根据分离的原理不同进行分类106

1.3.2 根据流动相的不同分类106

1.3.3 根据支持物的装填方式分类107

1.4 层析法理论概述107

1.4.1 分配定律107

1.4.2 分配层析的机理108

1.4.3 塔板理论110

1.5 层析法的发展趋势113

第二章 纸层析115

2.1 纸层析的基本原理115

2.1.1 纸层析的机理115

2.1.2 Rf值115

2.1.3 物质的化学结构与Rf值之间的关系116

2.1.3.1 物质极性对Rf值的影响116

2.1.3.2 Rm值及其与物质化学结构的关系117

2.1.3.3 二肽的结构与Rf值的关系117

2.1.4 实验条件与Rf值的关系118

2.1.4.1 溶剂系统对Rf值的影响118

2.1.4.2 温度对Rf值的影响118

2.1.4.3 展层方式对Rf值的影响119

2.1.4.4 共存物质对Rf值的影响119

2.1.4.5 展层剂所走距离和纸的种类对Rf值的影响119

2.2 溶剂系统119

2.2.1 选择溶剂系统的原则119

2.2.2 多元溶剂系统120

2.2.3 一些有机溶剂系统的精制方法120

2.3 滤纸121

2.3.1 滤纸的选择121

2.3.2 常用的层析滤纸121

2.3.3 滤纸的净化122

2.4 纸层析的实验技术122

2.4.1 纸层析的展层方法及装置122

2.4.2 滤纸的裁剪126

2.4.3 加样方法127

2.4.4 饱和与展层128

2.4.5 图谱的显示128

2.4.6 Rf值的测定129

2.4.7 定量方法130

2.5 特殊类型的纸层析132

2.5.1 纸堆层析132

2.5.2 反相层析132

2.5.3 盐析纸层析132

2.5.4 用被吸附剂处理过的滤纸进行层析分离133

2.5.5 高温纸层析133

2.6 实验举例134

2.6.1 氨基酸单向纸层析标准曲线测定134

2.6.2 氨基酸的双向纸层析135

2.6.3 核苷酸的纸层析135

2.6.4 糖的纸层析136

2.6.5 用环形纸层析分离茶叶中的咖啡因136

2.6.6 用反相纸层析分离高级脂肪酸136

附录一 纸层析常用的溶剂系统137

附录二 纸层析的重要显色剂的配制138

第三章 离子交换柱层析141

3.1 引言141

3.2 离子交换树脂142

3.2.1 离子交换树脂的分类142

3.2.2 离子交换树脂的合成142

3.2.3 离子交换树脂合成举例144

3.2.3.1 阳离子交换树脂144

3.2.3.2 阴离子交换树脂145

3.2.4 离子交换树脂的性质145

3.2.4.1 离子交换树脂的物理性质145

3.2.4.2 离子交换树脂的化学性质146

3.3 离子交换平衡和选择性149

3.4 离子交换动力学151

3.5 离子交换柱层析的基本原理152

3.6 离子交换柱层析的实验技术154

3.6.1 离子交换树脂的选择154

3.6.2 树脂颗粒大小的选择和处理154

3.6.2.1 树脂的筛选和浮选154

3.6.2.2 树脂的处理155

3.6.3 仪器设备156

3.6.3.1 层析柱156

3.6.3.2 恒流装置156

3.6.3.3 分部收集装置157

3.6.4 离子交换层析的操作步骤+157

3.6.4.1 柱的装填157

3.6.4.2 加样和洗脱158

3.6.4.3 洗脱液的分析158

3.6.4.4 树脂的再生159

3.7 离子交换柱层析在生物化学上的应用159

3.7.1 氨基酸的层析分离159

3.7.1.1 树脂159

3.7.1.2 仪器设备159

3.7.1.3 样品的处理159

3.7.1.4 加样、洗脱和收集160

3.7.1.5 定量测定160

3.7.2 肽的分离161

3.7.2.1 层析的样品161

3.7.2.2 操作步骤161

3.7.2.3 结果分析161

3.7.3 核酸衍生物的分离161

附录162

第四章 离子交换纤维素层析172

4.1 引言172

4.2 离子交换纤维素172

4.2.1 离子交换纤维素的分类172

4.2.2 离子交换纤维素的性质173

4.2.2.1 DEAE-纤维素173

4.2.2.2 TEAE-纤维素174

4.2.2.3 ECTEOLA-纤维素175

4.2.2.4 CM-纤维素175

4.2.2.5 P-纤维素175

4.2.3 离子交换纤维素的合成175

4.2.3.1 CM-纤维素的合成175

4.2.3.2 DEAE-纤维素的合成176

4.3 吸附与解吸177

4.3.1 牢固吸附和有限吸附平衡177

4.3.2 梯度洗脱179

4.3.3 阶段洗脱181

4.3.4 pH变化对吸附与解吸的影响181

4.4 层析条件的选择182

4.4.1 样品性质的鉴定和处理182

4.4.2 离子交换纤维素的选择182

4.4.3 交换剂颗粒大小的选择183

4.4.4 缓冲溶液的选择183

4.5 实验步骤184

4.5.1 离子交换纤维素的处理184

4.5.1.1 细颗粒的除去184

4.5.1.2 离子交换纤维素的洗涤184

4.5.1.3 离子交换纤维素pH的调节184

4.5.2 装柱185

4.5.2.1 重力沉降法185

4.5.2.2 加压法185

4.5.3 加样186

4.5.3.1 加样量186

4.5.3.2 样品的准备186

4.5.3.3 加样的方法187

4.5.4 洗脱187

4.5.5 洗脱液的收集与分析187

4.5.6 洗脱液的鉴定187

4.5.7 再层析分离187

4.5.8 浓缩187

4.5.8.1 离子交换法188

4.5.8.2 超滤法188

4.5.8.3 用吸水剂处理188

4.6 离子交换纤维素柱层析在生物化学中的应用举例188

4.6.1 小牛胸腺组蛋白的分离188

4.6.1.1 样品的制备188

4.6.1.2 层析分离188

4.6.2 肽的分离189

4.6.3 人血清白蛋白的分离与提纯189

4.6.3.1 试剂配制189

4.6.3.2 样品处理190

4.6.3.3 分离190

第五章 凝胶层析191

5.1 引言191

5.2 凝胶层析的原理191

5.2.1 凝胶层析的简单模型191

5.2.2 分配系数Kd192

5.2.3 Ve、Vav与分子量的关系194

5.3 层析凝胶195

5.3.1 层析凝胶的必备条件195

5.3.2 葡聚糖凝胶196

5.3.3 聚丙烯酰胺凝胶198

5.3.4 交联丙烯基葡聚糖凝胶198

5.3.5 琼脂糖凝胶199

5.3.6 凝胶离子交换剂203

5.4 凝胶层析的实验技术203

5.4.1 凝胶型号的选择203

5.4.2 凝胶颗粒大小的选择204

5.4.3 洗脱剂的选择205

5.4.4 凝胶的溶胀205

5.4.5 凝胶柱的装填206

5.4.6 调节流速207

5.4.7 加样207

5.4.8 洗脱209

5.4.9 重新装填209

5.5 影响凝胶层析的主要因素209

5.5.1 样品209

5.5.2 柱210

5.5.3 凝胶颗粒大小211

5.6 实验举例212

5.7 凝胶的防霉与保存方法213

5.7.1 防霉方法213

5.7.2 保存方法214

第六章 亲和层析215

6.1 引言215

6.2 亲和层析的基本原理215

6.2.1 亲和层析的简单模型215

6.2.2 生物大分子对配体的亲和力217

6.3 配体218

6.3.1 配体的必要条件218

6.3.2 纯化酶所需的配体218

6.3.3 纯化酶抵制剂所需的配体219

6.3.4 纯化结合维生素的蛋白质的配体219

6.3.5 纯化激素受体的配体220

6.3.6 纯化抗原和抗体的配体220

6.3.7 提纯小分子化合物所需要的配体220

6.3.8 纯化核酸的配体221

6.4 “手臂”222

6.4.1 载体的空间位阻和“手臂”的作用222

6.4.2 “手臂”的长度223

6.4.3 “手臂”的性质224

6.5 载体225

6.5.1 载体的必要条件225

6.5.2 琼脂糖凝胶226

6.5.3 交联琼脂糖凝胶227

6.5.4 聚丙烯酰胺凝胶228

6.5.5 聚丙烯酰胺--琼脂糖凝胶(AcA)228

6.5.6 葡聚糖凝胶229

6.5.7 纤维素229

6.5.8 多孔玻璃230

6.6 配体和载体的偶联231

6.6.1 配体与多糖载体的偶联231

6.6.1.1 溴化氰活化法231

6.6.1.2 三嗉活化法232

6.6.1.3 高碘酸盐氧化法232

6.6.1.4 环氧乙烷法233

6.6.1.5 配体与多糖载体的其他偶联方法234

6.6.2 配体与聚丙烯酰胺凝胶载体的偶联234

6.6.2.1 聚丙烯酰胺凝胶直接活化法234

6.6.2.2 共聚法235

6.6.3 配体与多孔玻璃载体的偶联235

6.6.4 蛋白质配体与载体偶联的问题236

6.7 接“手臂”236

6.8 亲和层析技术238

6.8.1 亲和层析的操作方式和步骤238

6.8.2 非专一性洗脱239

6.8.3 专一性洗脱241

6.8.4 亲和吸附剂的再生方法242

6.8.5 影响亲和层析的因素242

6.8.5.1 样品体积和流速的影响242

6.8.5.2 温度对亲和层析的影响243

6.9 实验举例243

6.9.1 尿激酶的纯化243

6.9.2 a-胰凝乳蛋白酶的提纯243

第七章 气相层析245

7.1 概况245

7.1.1 气相层析的进展245

7.1.2 气相层析的分类245

7.1.3 气相层析仪流程246

7.1.4 气相层析的特点246

7.2 基本概念和基本理论247

7.2.1 层析图247

7.2.2 基线247

7.2.3 峰高247

7.2.4 峰面积247

7.2.5 峰宽与半峰宽247

7.2.6 死时间t0和死体积V0247

7.2.7 保留时间tR和保留体积VR248

7.2.8 实际保留时间t R248

7.2.9 校正保留时间t？和校正保留体积V？248

7.2.10 保留温度TR(K)248

7.2.11 比保留体积Vg248

7.2.12 相对保留值248

7.3 气相层析仪249

7.3.1 气路系统249

7.3.2 进样系统250

7.3.3 温度控制系统251

7.3.4 层析柱252

7.4 检测器252

7.4.1 检测器的应答值252

7.4.1.1 检测器应答值的定义252

7.4.1.2 检测器应答值的测定253

7.4.1.3 相对应答值254

7.4.2 检测器的敏感度254

7.4.3 热导池检测器254

7.4.4 氢焰离子化检测器(氢焰检测器)255

7.4.4.1 氢焰检测器的工作原理255

7.4.4.2 氢焰检测器离子室的结构256

7.4.4.3 氢焰检测器的操作条件256

7.4.5 电子捕获检测器257

7.4.5.1 电子捕获检测器的结构和工作原理257

7.4.5.2 工作条件的选择257

7.5 固定相258

7.5.1 固体固定相258

7.5.2 固定液262

7.5.2.1 固定液必须具备的条件262

7.5.2.2 影响组分在固定液中溶解度的因素262

7.5.2.3 固定液的选择263

7.5.2.4 固定液的涂渍和老化264

7.5.3 层析柱的填充方法264

7.5.3.1 填充性的装填方法264

7.5.3.2 毛细管柱的涂渍方法265

7.6 担体265

7.6.1 担体的分类265

7.6.2 硅藻土型担体266

7.6.2.1 红色担体266

7.6.2.2 白色担体266

7.6.2.3 硅藻土型担体的处理方法266

7.6.3 非硅藻土型担体268

7.6.3.1 玻璃微球268

7.6.3.2 氟担体268

7.6.4 担体的选择269

7.7 定量分析269

7.7.1 峰面积的测量方法270

7.7.1.1 几何图解法270

7.7.1.2 峰高乘保留时间法270

7.7.1.3 自动积分仪法270

7.7.1.4 求积仪法271

7.7.1.5 剪纸称重法271

7.7.1.6 未完全分离峰面积的测量271

7.7.2 定量方法271

7.7.2.1 归一化法271

7.7.2.2 外标法272

7.7.2.3 内标法272

7.7.2.4 内加法273

7.8 气相层析在氨基酸分析上的应用274

7.8.1 氨基酸用三氟乙酸酐(TFAA)酰化274

7.8.2 氨基酸的PTH化275

第三篇 区带电泳法277

第一章 绪论277

1.1 电泳法发展简史277

1.2 何谓区带电泳279

1.3 理论概要281

1.3.1 迁移率281

1.3.2 pH变化对带电物质离子化的响影283

1.3.3 胶体颗粒的电动电位286

1.3.4 电渗与电渗的校正289

1.3.5 带电质点在支持介质上的迁移率291

第二章 纸电泳294

2.1 纸电泳的一般方法294

2.1.1 直流电源294

2.1.2 电极294

2.1.3 分析的样品295

2.1.4 支持滤纸的方法295

2.1.4.1 平卧法295

2.1.4.2 悬挂法295

2.1.5 滤纸的选择297

2.1.6 缓冲液溶的选择297

2.1.7 点样298

2.1.8 电泳条件299

2.1.9 分离样品的定位--定性检定299

2.1.10 定量测定301

2.2 双向纸电泳301

2.2.1 两向均为电泳301

2.2.2 一向电泳，一向层析301

2.2.2.1 先电泳后层析或先层析后电泳302

2.2.2.2 同时进行电泳和层析302

2.3 连续纸电泳302

2.4 高压纸电泳303

2.4.1 一般介绍303

2.4.2 生物液体中氨基酸的分离305

2.4.3 肽段的分离306

2.4.3.1 制备混合肽306

2.4.3.2 电泳和层析两向分离307

2.4.3.3 作指纹图谱308

第三章 薄层电泳311

3.1 引言311

3.2 一般方法要点311

3.2.1 电泳 置311

3.2.2 薄层材料312

3.2.3 缓冲溶液312

3.2.4 薄层板的制备312

3.2.5 加样及电泳313

3.2.6 薄层板的冷冻干燥处总313

3.3 层析电泳双向分离法313

3.3.1 制作肽图的一般过程313

3.3.2 制作肽图的步骤314

3.3.2.1 蛋白质的水解314

3.3.2.2 先层析后电泳双向分离制成肽图314

3.4 凝胶过滤-电泳双向薄层方法314

3.4.1 Sephadex薄层板的制备315

3.4.2 凝胶过滤315

3.4.3 电泳316

3.4.4 检出分离的蛋白质分部316

3.5 应用举例316

3.5.1 检测用荧光胺标记的伯胺类物质316

3.5.1.1 荧光团的制备316

3.5.1.2 薄层层析316

3.5.1.3 电泳317

3.5.2 用荧光胺作为喷洒试剂在肽图上检测分离的肽317

3.5.3 氨基酸的双向分离317

第四章 醋酸纤维膜电泳319

4.1 醋酸纤维膜电泳的特点319

4.2 电泳装置319

4.2.1 通用型电泳槽319

4.2.2 小型电泳槽320

4.3 缓冲溶液320

4.4 电泳分离前膜的准备321

4.5 加样321

4.6 电泳322

4.7 分离区带的检测323

4.7.1 染色323

4.7.1.1 一般蛋白质染色323

4.7.1.2 糖蛋白染色324

4.7.1.3 脂蛋白染色324

4.7.2 洗涤脱色324

4.7.3 染色膜的干燥和透明324

4.7.4 膜的检定325

4.8 应用举例325

4.8.1 血红蛋白的分离325

4.8.1.1 血红蛋白溶液的制备325

4.8.1.2 加样326

4.8.1.3 电泳326

4.8.1.4 检定326

4.8.2 血清中结合珠蛋白的测定326

4.8.2.1 原理326

4.8.2.2 电泳327

4.8.2.3 检定327

4.8.3 同工酶的分离检定327

4.8.3.1 所需试剂327

4.8.3.2 操作步骤中的注意点327

4.8.4 核苷酸的分离328

4.8.5 氨基酸分析328

4.9 实验结果不满意或实验失败的可能原因329

4.9.1 醋酸纤维膜329

4.9.2 缓冲溶液329

4.9.3 样品和加样329

4.9.4 电泳329

4.9.5 染色和透明330

第五章 凝胶免疫电泳331

5.1 引言331

5.2 琼脂凝胶免疫电泳方法333

5.2.1 琼脂凝胶的制备333

5.2.2 电泳333

5.2.3 免疫沉淀333

5.3 高压琼脂免疫电泳333

5.4 定量免疫电泳334

5.4.1 定量免疫电泳的依据和要求334

5.4.2 定量免疫电泳所需的试剂335

5.4.2.1 电泳支持介质--琼脂糖335

5.4.2.2 缓冲溶液335

5.4.2.3 染色溶液和脱色溶液335

5.4.2.4 抗体(抗血清)335

5.4.3 火箭免疫电泳336

5.4.3.1 电泳板的制备336

5.4.3.2 电泳337

5.4.3.3 检定337

5.4.4 双向免疫电泳338

5.4.4.1 手工双向免疫电泳法338

5.4.4.2 半自动双向免疫电泳法338

5.4.4.3 双向免疫电泳图谱的检定339

5.4.4.4 双向免疫电泳的应用340

5.4.5 定量免疫电泳存在的问题340

5.4.6 免疫电泳方法中应注意的一些问题341

5.5 其他形式的免疫电泳简介343

5.5.1 交叉免疫电泳343

5.5.2 薄层凝胶过滤免疫电泳345

5.5.3 放射对流免疫电泳346

5.5.4 线形免疫电泳347

第六章 聚丙烯酰胺凝胶电泳351

6.1 引言351

6.2 聚丙烯酰胺凝胶352

6.2.1 凝胶的结构及用量计算352

6.2.2 凝胶的催化聚合过程354

6.2.3 凝胶的分子筛效应355

6.2.4 凝胶的浓度，交联度和不同颗粒电泳迁移率之间的关系355

6.3 不连续 盘电泳原理概要356

6.4 缓冲溶液的选择原则358

6.5 分析圆盘电泳方法360

6.5.1 必要的设备360

6.5.2 凝胶组成成分的化学、物理性质360

6.5.3 丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺浓度的测定方法362

6.5.4 单体的纯度问题和纯化方法362

6.5.5 凝胶系统及其组成363

6.5.6 圆柱形凝胶的制备363

6.5.6.1 分离胶的制备363

6.5.6.2 堆集胶的制备367

6.5.6.3 样品胶的制备367

6.5.6.4 影响凝胶聚合的因素367

6.5.7 电泳368

6.5.7.1 安装电泳管368

6.5.7.2 加样368

6.5.7.3 加电极缓冲液368

6.5.7.4 加指示染料369

6.5.7.5 电泳369

6.5.8 凝胶的取出370

6.5.9 凝胶的固定和染色--分离区带的检定370

6.5.9.1 蛋白质的一般染色方法370

6.5.9.2 含金属蛋白质的染色371

6.5.9.3 脂蛋白的染色371

6.5.9.4 糖蛋白的染色371

6.5.9.5 核酸的染色371

6.5.10 脱色371

6.5.11 定量分析372

6.5.11.1 切片抽提法372

6.5.11.2 微量光密度计法372

6.5.11.3 计数法373

6.5.11.4 放射自显影法373

6.6 蛋白质分子量的测量373

6.6.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量的根据和要求373

6.6.2 求商法测定分子量374

6.7 分析RNA时应注意的一些问题375

6.7.1 制胶375

6.7.2 RNA样品问题375

6.7.3 缓冲溶液的离子强度376

6.7.4 电泳时的温度376

6.7.5 其他的注意事项376

6.8 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳376

6.8.1 概况376

6.8.2 测定分子量的SDS凝胶电泳方法378

6.8.2.1 试剂的配制378

6.8.2.2 凝胶的制备378

6.8.2.3 样品液的制备380

6.8.2.4 电泳步骤380

6.8.2.5 检定382

6.8.3 凝胶的保存方法383

6.8.3.1 湿法保存凝胶383

6.8.3.2 干法保存凝胶383

6.8.4 影响蛋白质电泳迁移率造成分子量测定误差的因素383

6.8.4.1 SDS的结合程度384

6.8.4.2 样品本身的荷电性质384

6.8.4.3 蛋白质分子量和分子大小384

6.8.4.4 其他影响因素384

6.8.5 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量的局限性384

6.9 双向聚丙烯酰胺凝胶电泳385

第七章 制备电泳387

7.1 引言387

7.2 制备性圆盘电泳装置A型387

7.2.1 电极缓冲液室388

7.2.2 电泳柱388

7.2.3 环形洗脱室388

7.2.4 法兰锤体388

7.2.5 夹环388

7.2.6 电泳步骤389

7.2.6.1 凝胶溶液、电极缓冲液和冲洗缓冲液的配制389

7.2.6.2 电泳装置各部件的组装和电泳389

7.2.7 几点讨论390

7.3 制备性圆盘电泳装置B型391

7.3.1 电泳装置的几个主要部件391

7.3.1.1 凝胶支持管391

7.3.1.2 绝热套392

7.3.1.3 透析滤膜和膜的固定环392

7.3.1.4 缓冲液槽392

7.3.1.5 电极392

7.3.2 具体操作392

7.3.2.1 选择缓冲液392

7.3.2.2 凝胶柱的制备393

7.3.2.3 电泳体系的性能试验393

7.3.2.4 加样394

7.3.3 应注意的几个问题394

7.4 若干种蛋白质的分离制备条件395

7.5 Pevikon制备板电泳396

7.5.1 电泳装置396

7.5.2 电泳步骤396

7.5.2.1 支持介质Pevikon的处理396

7.5.2.2 制Pevikon电泳板396

7.5.2.3 加样397

7.5.2.4 分离区带的分段回收397

7.5.3 高压制备板电泳397

7.5.3.1 高压制备板电泳装置398

7.5.3.2 电泳前应注意的几个问题398

7.5.4 应用举例399

7.5.4.1 糖肽和糖蛋白的分离399

7.5.4.2 蛋白类的分离399

7.5.4.3 尿中肽类的分离399

7.5.4.4 血清中球蛋白的分离399

第八章 等电聚焦401

8.1 等电聚焦的基本原理401

8.2 pH梯度的组成401

8.3 人工合成的载体两性电解质402

8.4 稳定介质403

8.5 密度梯度柱等电聚焦403

8.5.1 U型管等电聚焦方法403

8.5.2 Vesterberg和Svensson的等电聚焦方法404

8.5.3 Grant和Leaback的等电聚焦方法407

8.5.3.1 Isco密度梯度电泳柱的特点407

8.5.3.2 进行等电聚焦所需的必要部件以及所用的几种溶液407

8.5.3.3 不在中心管内进行分析的等电聚焦操作步骤409

8.5.3.4 在中心管内进行分析的等电聚焦操作步骤410

8.5.4 对密度梯度等电聚焦方法的几点讨论410

8.5.4.1 二性载体的选择410

8.5.4.2 样品411

8.5.4.3 对聚焦带的检测412

8.5.4.4 二性载体的去除412

8.6 凝胶介质中的等电聚焦412

8.6.1 凝胶等电聚焦的特点412

8.6.2 柱状凝胶等电聚焦413

8.6.2.1 装置413

8.6.2.2 凝胶的制备413

8.6.2.3 加样414

8.6.2.4 等电聚焦操作步骤414

8.6.3 薄层凝胶等电聚焦416

8.6.3.1 装置416

8.6.3.2 薄层凝胶的制备417

8.6.3.3 加样419

8.6.3.4 等电聚焦步骤中需要注意的问题419

8.7 对方法的几点讨论420

第四篇 放射免疫法422

第一章 放射免疫测定的基本知识422

1.1 引言422

1.2 术语422

1.3 放射免疫测定的早期发展史423

1.4 结合测定的基本原理424

1.5 结合体稀释曲线和标准曲线426

1.6 标准曲线的不同制作方法429

1.7 K值的重要性431

1.8 K值的测定431

1.9 放射免疫测定的缓冲液和常用添加剂432

第二章 放射免疫测定需要一个纯化的抗原434

2.1 结合测定的要求434

2.2 需要一个纯化的抗原(配体)434

2.3 纯配体的优越性435

2.3.1 大分子蛋白激素436

2.3.2 癌胚抗原436

2.3.3 类固醇激素和药物436

2.3.4 小肽激素437

2.4 纯化的配体与内源性配体的不一致性437

2.5 标准品438

2.6 材料的贮藏440

第三章 放射免疫测定需求一个标记的抗原442

3.1 放射性同位素442

3.2 放射性同位素的计数443

3.3 计数仪的选择444

3.4 同位素计数方面的某些问题445

3.5 标记物的基本特性446

3.6 标记物的制备446

3.7 碘化标记物447

3.7.1 碘化法447

3.7.2 碘化作用的损伤449

3.7.3 碘化标记物的纯化451

3.7.4 标记物的化学分析452

第四章 放射免疫测定对抗体的要求455

4.1 抗体的化学性质455

4.2 抗原的化学性质456

4.3 免疫应答的细胞学基础456

4.4 免疫反应的生理学457

4.5 放射免疫测定所需抗体的性质457

4.6 抗体的产生458

4.7 免疫原的性质和剂量459

4.8 作为免疫原的半抗原的制备459

4.9 佐剂461

4.10 动物的品种461

4.11 免疫的途径461

4.12 注射时间和采抗血清的时间462

4.13 对于放射免疫抗血清的选择463

4.14 抗体的贮存464

第五章 放射免疫测定时游离相与结合相的分离465

5.1 分离方法的有效性465

5.2 分离方法的实用性466

5.3 分离游离相和结合相的方法467

5.3.1 电泳467

5.3.2 凝胶过滤467

5.3.3 吸附方法468

5.3.3.1 活性炭吸附468

5.3.3.2 硅胶和硅藻土的吸附468

5.3.3.3 羟基磷灰石469

5.3.4 分部沉淀469

5.3.5 双抗体法470

5.3.5.1 “双抗体”或“第二”抗体470

5.3.5.2 固相化的第二抗体471

5.3.6 固相体系472

5.3.6.1 结合体附着到圆盘和试管壁表面472

5.3.6.2 结合体连接到特殊的固相上472

5.3.7 结论：分离步骤的选择473

第六章 放射免疫测定的灵敏度474

6.1 灵敏度(sensitivity)的定义474

6.2 增加放射免疫测定灵敏度的方法475

6.2.1 减少标记物的用量475

6.2.2 减少结合体的用量476

6.2.3 增加保温时间476

6.2.4 减少保温时间--非平衡分析法477

6.2.5 试剂加入的顺序477

6.2.6 采用亲和力高的抗体478

6.2.7 增加样品的体积478

6.2.8 提高保温的温度478

6.2.9 增加样品重复测定的次数479

6.2.10 抽提和浓缩配体479

6.3 降低放射免疫测定灵敏度的方法479

6.4 放射免疫测定的靶区--范围的重要性480

6.5 结论481

第七章 放射免疫测定的特异性482

7.1 特异性(specificity)的定义482

7.2 专一的非特异性(specific non-specificity)482

7.2.1 专一的非特异性的基础482

7.2.2 专一的非特异性的估计483

7.2.3 改进特异性的方法485

7.3 非专一的非特异性(non-specific non-specificity)486

7.3.1 样品中存在干扰抗原-抗体反应的物质487

7.3.2 样品中空白值的变化487

7.3.3 抗体或标记物的破坏或掩蔽487

7.3.4 未标记配体的破坏或掩蔽488

7.3.5 非专一的非特异性作用的判别和去除488

第八章 放射免疫测定的精确性490

8.1 精确性(precision)的定义490

8.2 影响精确性的因素490

8.2.1 试剂和分析设计中的问题490

8.2.2 分析过程中操作的差错493

8.3 监测结合分析精确性的方法494

8.3.1 对于监测精确性的质量控制物质的制备494

8.3.2 用质量控制物质来检查精确性的方法495

8.3.3 监测精确性的其他方法497

8.4 结合测定最适精确性方法的建立498

8.5 在放射免疫测定中对精确性评价方面国内的一些建议498

第九章 放射免疫测定与其他分析类型的关系500

9.1 对测定方法的要求500

9.2 受体分析(Receptor Assay)500

9.3 血液结合蛋白分析(circulating binding protein assays)501

9.4 免疫分析(immunoassays)501

9.5 结论503

第十章 放射免疫测定操作的安全预防措施504

10.1 放射免疫实验室中的放射性危险504

10.2 管理总则504

10.3 标记规则505

10.4 实验室监测505

10.5 放射性废物处理505

10.6 放射免疫实验室的设计506