《表1 定量RT-PCR引物序列》

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《人肺腺癌中癌相关成纤维细胞的分离培养与初步分析》

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实验组A549与CAFs共培养，Transwell上室接种CAFs，对照组A549单独培养，无血清条件下培养72 h，加入适量的RNAiso Plus收集细胞，室温静置5 min，加入1/5提及的氯仿混合为匀浆，静置5 min后，12 000 g 4℃离心15 min。取上清，加入等体积的异丙醇混匀静置10 min，12 000 g 4℃离心10 min，小心弃去液体。在沉淀中加入1 mL的75%的乙醇清洗，12 000 g 4℃离心5 min后干燥几分钟，使用DEPC水溶解总RNA。使用Takara逆转录试剂盒，将RNA逆转录为cDNA并稀释20倍，作为定量PCR模板，反应体系10μL。反应程序为：95℃预变性10 s，95℃变性5 s，58℃退火15 s，72℃延伸15 s，设定39个循坏，72℃～95℃溶解曲线分析5 s。GAPDH作为内参，基因引物见表1。采用2-ΔΔCt法进行相关基因表达结果分析。