《表1 mi R-34a甲基化引物信息》

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《结直肠癌组织miR34a启动子区甲基化状态的临床意义探讨》

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采用甲基化特异性PCR（MSP）法。通过在线Meth-Primer软件（http://www.urogene.org/methprimer/）设计甲基化、非甲基化序列的引物（其信息见表1[5]），以亚硫酸氢钠修饰后的DNA为模板进行PCR扩增:95℃预变性10min，94℃15s，共40个循环；55℃30s，72℃40s，再72℃延伸10min。非甲基化扩增体系的退火温度提高至56℃，其他步骤相同。扩增产物为2.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外光照射显带。RT-PCR:取1～2μl甲基化修饰型DNA进行PCR，扩增产物为2.5%琼脂糖凝胶电泳，然后紫外光照射显带，确定与引物互补的DNA序列甲基化状态。对PCR产物进行电泳，并根据电泳条带情况进行判定:（1）甲基化特异性引物扩增出目的条带，而非甲基化特异性引物未扩增出条带，为甲基化；（2）非甲基化特异性引物扩增出目的条带，而甲基化引物未扩增出条带，为非甲基化；（2）对引物均能扩增出目的条带的半甲基化，判断为甲基化。