《表2 去除基因组DNA反应》

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《六溴环十二烷(HBCD)对H4细胞和SK-N-AS细胞脱碘酶2和3表达的影响》

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取生长对数期的SK-N-AS、H4细胞，分别用0、1、3和9μmol·L-1HBCD处理24 h，用TransZol Up试剂盒提取总RNA，超微量核酸分析仪分析RNA的纯度，保证无污染及降解。Dio2、Dio3以及GAP-DH基因引物序列见表1。将1μg的总RNA逆转录成cDNA，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit的说明操作，具体反应步骤如下:首先去除基因组DNA（表2），再进行反转录（表3），然后按照SYBRPremix Ex TaqTM试剂盒说明，构建qRT-PCR的反应体系（表4）。反应在八联管中进行，置于PCR仪上进行实时荧光定量反应。PCR反应条件为:预变性95℃、30 s；95℃、3 s，60℃、30 s，循环40次；95℃、15 s，60℃、30 s，95℃、15 s；每次实验均设置阴性对照，检验引物质量。观察目的基因的扩增曲线及溶解曲线，需满足特异性及灵敏性的要求，以GAPDH的表达量对结果进行标准化，实验重复3次以上。