《表1 5种RAD-seq技术的比较》

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《系统发育基因组学方法研究进展》

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简化基因组测序（reduced-representation genome sequencing）是指利用限制性内切酶消化基因组DNA，回收特定长度的酶切片段并进行高通量测序.这类测序技术能够大幅度降低物种基因组复杂程度，显著降低测序成本，广泛应用在SNP标记开发、基因分型、群体遗传结构研究等方面.在系统发育基因组学中，常被用来解决低阶元系统发育关系和谱系地理学中的问题，代表方法有限制性酶切位点关联DNA测序（restriction-site associated DNA sequencing，RAD-seq）[43，44]、简化多态序列复杂度测序（complexity reduction of polymorphic sequences，CRoPS）[45]、简化代表文库测序（reduced-representation libraries sequencing，RRLs）[46]、基因分型测序（genotyping by sequencing，GBS等[47].其中应用最为广泛的标准RAD-seq是利用限制性核酸内切酶消化物种基因组DNA，在酶切基因组片段两端添加P1测序接头，随后对片段进行打断处理，回收一定大小范围的片段后加上P2测序接头，PCR扩增富集同时具有P1和P2接头的DNA片段，最后进行高通量测序.该技术实验操作简单、成本低、无需参考基因组，能够高效地获取大量SNP标记用于系统发育关系构建和群体遗传结构分析.如Meier等人[48]为了探究维多利亚湖流域丽鱼的爆炸性适应辐射过程，对该流域的156个慈鲷科物种进行RAD-seq，获得了436166个SNP位点，建树结果表明所有来自维多利亚湖流域的丽鱼呈单系起源且绝大多数内部节点的Bootstrap支持率大于90%，证明利用RAD-seq数据能够很好地解析辐射进化生物类群的系统关系.然而，RAD-seq方法对样本DNA质量要求较高[49]，不能应用在DNA高度降解的样本中.除此之外，当分析进化跨度大的生物类群时，由于不同进化枝中的类群所共有的酶切位点会发生丢失，RAD-seq测序会存在直系同源核酸序列数据集缺失率高 (missing data）、遗传多样性估算存在偏差，发现无效等位基因（null alleles）等问题[50～52].近年来基于RAD-seq的改进方法不断涌现，包括2b-RAD[53，54]，ddRAD[55]，ezRAD[56]，Rapture[57]等.本文从DNA降解的影响，实验操作流程、实验成本等方面对这些RAD技术进行比较（表1），不同的研究学者可结合研究类群的特点、研究目的等，选择最佳的实验技术手段.