《表1 特异性扩增Nt SOD、Nt CAT和Nt POD家族基因引物》

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《小麦TaWRKY46介导转基因烟草耐盐性的功能分析》

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SOD：超氧化物歧化酶；POD：过氧化物酶；CAT：过氧化氢酶；下同

以上述营养液培养的WT和过表达株系OE1和OE5的烟草根系为材料。参照Huang等（2010）的方法测定保护酶，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化物酶（peroxidase，POD）和过氧化氢酶（catalase，CAT）的活性。采用逆转录PCR （reverse transcription PCR，RT-PCR）对包含4个SOD基因、6个CAT基因和9个POD基因在内的抗氧化酶相关基因进行表达特征分析。特异性RT-PCR扩增引物见表1，以组成型表达的烟草肌动蛋白基因Ntactin作为内参进行RT-PCR。本部分所有试剂来自宝生物工程有限公司（大连）。首先使用Trizol提取WT、OE1和OE5的根部RNA并测定浓度，用SMART?MMLV Reverse Transcriptase反转录酶合成双链c DNA，检测浓度后用作PCR的模板。PCR反应体系为10μL:c DNA模板1μL，上下游引物各0.2μL，dd H2O 5μL，2×Es Taq Master Mix5μL，dd H2O 3.6μL。首先以内参基因Ntactin的引物进行PCR。PCR反应程序设置为：94℃预变性5min；94℃变性45 s，55℃，45 s；72℃35 s，25个循环；72℃充分扩增10 min；4℃保存。通过微调c D‐NA模板的量使Ntactin条带亮度达到一致，然后应用上述PCR体系，利用表1的引物进行保护酶的RT-PCR，反应程序同上，循环数为25个。