《表2.本研究所用主要质粒》

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《可同化阿拉伯糖的木糖还原酿酒酵母菌株构建》

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根据National Center for Biotechnology Information上登记的来源于植物乳杆菌分别编码L-阿拉伯糖异构酶（Gen Bank accession No.CCC80517.1）、L-核酮糖激酶（Gen Bank accession No.CCC80519.1）、L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶（Gen Bank accession No.CCC80518.1）的基因序列，参考酿酒酵母密码子碱基偏好性对3个基因进行了密码子优化，由苏州金唯智生物科技有限公司进行了基因合成。利用含有密码子优化的ara A、ara B、ara D基因的3种质粒ara A、ara B、ara D in p UG35-Kan MX构建重组质粒。以HXT7p-F和HXT7p-R为正、反引物扩增菌株KF-7基因组中的HXT7启动子，经SpeⅠ-SmaⅠ双酶切体系酶切纯化后与ara B in p UG35-Kan MX质粒使用T4 DNA连接酶连接，转化于E.coli DH5α感受态细胞中，转化子培养后抽提得到重组质粒ara B in p UG35-Kan-PHXT7。将引物替换为TEF1p-F和TEF1p-R，使用上述同样方法扩增菌株KF-7基因组中的TEF1启动子，转化后抽提得到重组质粒ara D in p UG35-Kan-PTEF1。以质粒ara B in p UG35-Kan-PHXT7为模板，使用引物ara B primer-F3和ara B primer-R3扩增ara B基因表达框PHXT7-ara B-TCYC1。以ara D in p UG35-Kan-PTEF1质粒为模板，使用引物ara D cassette-F和ara D cassette-R扩增ara D表达框PTEF1-ara D-TCYC1，扩增后同ara A in p UG35-Kan MX质粒经SpeⅠ和Bss HⅡ酶切纯化后进行连接，转化后抽提得到重组质粒ara Aara D in p UG35-Kan MX。以质粒ara Aara D in p UG35-Kan MX为模板，替换引物为ara Aara D Primer-F3和ara Aara D Primer-R3，扩增获得ara Aara D基因表达框PTEF1-ara D-TCYC1-PTDH3-ara A-TCYC1。