《表3 北柴胡种子的DNA提取和检测》

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《基于DNA条形码技术的北柴胡种子分子鉴定》

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单粒北柴胡种子约0.83 mg，低于中药材DNA条形码分子鉴定种子标准操作规程推荐的取样量40 mg，以及常规DNA提取试剂盒要求的取样量（新鲜组织100 mg或干燥组织20 mg）。分别考察不同取样量和不同水浴条件对DNA提取质量和PCR扩增成功率的影响，建立北柴胡种子DNA提取方法。结果表明DNA质量浓度与取样量呈正相关，随着取样量的增加，DNA质量浓度可提高8～10倍，但260，280 nm处吸光度比值A260 nm/A280 nm均处于1.8～2.0，见表3。采用ITS通用引物均可以获得明亮、单一的条带，见图4。但取样量5 mg和20 mg均为多粒种子样品，DNA提取过程中存在较大比例的胚乳组织，含有丰富蛋白、脂类等内含物，会影响后续实验；同时种子间易存在基因杂合现象，测序峰图容易存在杂峰，进而影响测序质量。不同水浴条件实验结果表明，65℃水浴2 h的DNA质量最优。综上分析，北柴胡种子DNA提取方法推荐采用单粒种子65℃水浴2 h。使用推荐的DNA提取方法对收集的40份正品北柴胡、红柴胡、三岛柴胡种子及19份市售北柴胡种子进行DNA提取，并采用ITS序列通用引物进行PCR扩增和双向测序，结果PCR扩增成功率和测序成功率均为100%。