《表3 RT-qPCR体系》

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《东北传统发酵食品中降胆固醇乳酸菌的筛选及其降解机制》

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以植物乳杆菌16S rRNA为内参基因[22-23]，根据NCBI数据库提供的基因序列分别设计bsh1、bsh2、bsh3、bsh4以及内参基因的引物（表2）。利用Trizol法提取乳酸菌的总RNA。将培养24 h的菌株离心（8 000×g、4 min、4℃），去除上清液并用无RNA酶磷酸盐缓冲溶液洗涤2次。取沉淀加入250μL溶菌酶，37℃水浴30 min。加入1 mL Trizol裂解液，体积比1∶5的氯仿，12 000×g、4℃离心15 min。取上清加入等体积异丙醇混匀静止后于12 000×g、4℃离心10 min获得RNA沉淀，用体积分数75%乙醇漂洗，晾干。利用FastQuant RT Kit(with gDNase）试剂盒反转录合成第1链cDNA。利用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green）试剂盒进行实时荧光定量PCR分析，反应体系见表3。反应程序：95℃预变性15 min；95℃变性10 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，循环40次。荧光定量的结果采用内参基因的ΔCt方法对目的基因的表达量进行分析（n=3）。目的基因的相对表达量公式为2-ΔCt。