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《核桃(Juglans regia L.)MicroRNA实时荧光定量RT-PCR内参基因的筛选》

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RT-qPCR因其快速、灵敏、特异等优势已被广泛用于基因的表达分析。选择合适的内参基因对数据进行标准化是得到正确结果的关键（尹冬梅等，2017）。理想内参基因在不同基因型、不同组织和不同实验条件下均能稳定表达。然而，大量研究表明并没有绝对稳定的基因（Kulcheski et al.，2010）。目前，关于miRNA定量分析的内参筛选多集中于医学及动物研究领域。在植物miRNA的定量分析中，5S rRNA（Qu et al.，2016）、5.8S rRNA（Sun et al.，2017）、18S r-RNA（Li et al.，2016）、U6 snRNA（Bai et al.，2016）等常用作内参基因。本研究中，U6 sn RNA的扩增效率E为211.1%，相关系数R2为0.600，不适合作为内参基因。这与小麦中U6 snRNA（E:458.6%；R2:0.648）不适合作为内参的结果一致（Feng et al.，2012）。在龙眼中，U6 snRNA稳定性最差（Lin and Lai，2013），而在柑橘中，U6 snRNA稳定性排名第二（Kou et al.，2012）。由此可见，U6 sn RNA在不同物种中表达量是不稳定的。采用RT-qPCR分析了特异性较强的8个候选内参基因在不同分化期花芽与叶芽、不同组织及品种中的表达量，并利用geNorm、Normfinder和RefFinder软件对其稳定性进行了评价。结果表明，没有一个候选内参基因在各实验中均稳定表达。在不同分化期花芽中，geNorm显示jre-miR159c为最稳定的单基因，jre-miR394a和jre-miR159a为最稳定的组合。V3/4小于0.15（图4E），需要三个内参基因，即jre-miR394a、jre-miR159a和jre-miR159c。Normfinder显示稳定性排名前三分别是jre-miR394a、jre-miR159a和jre-miR159c。RefFinder结果与Normfinder完全一致。在不同分化期叶芽中，geNorm显示最稳定的单基因为jre-miRn7，最稳定的组合为5.8S rRNA和jre-miRn3。V2/3小于0.15（图4E），最适的内参数目为2个，即5.8S r RNA和jre-miRn3。Normfinder则显示jre-miR167d最稳定，jre-miR159c、jre-miRn7和jre-miR394a次之。RefFinder显示5.8S rRNA最稳定，jre-miRn3、jre-miR394a和jre-miRn7次之。在生物胁迫和非生物胁迫下的小麦中，最适的内参基因为miR167和miR159（Feng et al.，2012）。在干旱胁迫下的大豆叶中，最适的单个内参基因为miR167a，最适的内参组合为miR167a与miR1520d（刘伟灿等，2016）。在梨中，miR167d稳定性一般，不同软件分析的结果也有差异（马鑫瑞等，2018）。表明miR167在不同物种中稳定性并非稳定不变。在进行miRNA定量分析时，应根据不同的物种或同一物种的不同组织筛选最适的内参基因。在不同组织和不同品种中，三种软件分析的最稳定的基因基本一致，只是排序有所差异。这种差异可能是由不同软件的统计算法导致的。此外，所有的V值均大于0.15，且随着内参数目n的增加，V值并没有太大变化（图4E）。在小麦不同组织和基因型（Feng et al.，2012）、石蒜属植物不同花期和不同组织中（蒋婷婷等，2015），所有V值也大于0.15。其原因可能是不同组织、不同品种和基因型跨度较大，样本数目不够或检测的内参基因数目有限。geNorm操作说明也提到Vn/n+1并非一定要设置为0.15（Vandesompele et al.，2002）。因此，在不同实验条件下，应结合不同软件筛选出最适的内参基因。