《表5 不同浓度荧光染料染色10min对11种海洋微藻的染色效率 (%) Table 5 The staining efficiency 11strains of marine microalgae

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《适合海洋微藻活体染色的方法评价》

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荧光素二乙酸酯（FDA）染色法是Rotman和Papermaser[22]提出的，FDA本身不发荧光，但该染料可被活细胞中的非特异性酯酶分解产生荧光物质，从而使细胞发荧光。死亡细胞或活性较差的细胞中由于非特异性酯酶活性差，因此无荧光或荧光较暗。该方法可用于鉴定细胞活性，具有价格低廉、操作简单和荧光信号较强等优点，因此被应用于植物和蓝藻研究[23]。CMFDA是FDA的氯甲基衍生物，同样具细胞膜渗透性，无色，不具有荧光发光性。当通过被动运输穿透细胞膜进入活细胞后，CMFDA中的亲脂性基团可被胞浆内非特异性酯酶水解，生成5-氯甲基荧光素（5-chloromethylfluorescein）；5-氯甲基荧光素可发出绿色荧光，因带电荷而不能自由穿透细胞膜，并利用自身氯甲基与细胞内蛋白和多肽中的谷胱甘肽在谷胱甘肽巯基转移酶作用下生成加合物，能完好地保留在胞内。经CMFDA标记的细胞，荧光非常稳定，与FDA相比，具有较长时间的细胞内信号保留特点。图3分别为3种海洋硅藻、2种海洋绿藻和6种海洋甲藻在荧光场和眀场下的照片，由图3可以看出，荧光染料充满整个单细胞微藻，使藻细胞整体呈绿色荧光。多重比较和染色效率结果（表4和表5）表明，染色最适浓度为FDA（5μmol/L）+CMFDA（2.5μmol/L），染色时间为10min，染色浓度和染色时间的增加对染色效果无显著性差异。溶于二甲基亚砜（DMSO）的FDA和CMFDA的单荧光与双荧光染色法对海洋微藻细胞没有抑制效应，一些运动型微藻，例如链状亚历山大藻、塔玛亚历山大藻、微小原甲藻、东海原甲藻、杜氏盐藻以及青岛大扁藻在荧光着色后，仍然游动。根据微藻所发出的荧光，不仅可以计算细胞数量，而且可以清楚观察微藻的细胞形态。