《表1 引物序列：P-loop,Bet v 1结构域的缺失及突变对GmPR10和Gly m 4l抑制大豆疫霉菌能力的影响》

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《"P-loop,Bet v 1结构域的缺失及突变对GmPR10和Gly m 4l抑制大豆疫霉菌能力的影响"》

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根据确定的突变及缺失位点及Fast Site-Directed Mutagenesis Kit快速定点突变试剂盒（购自TIANGEN公司）说明书中的引物设计原则进行引物设计（表1）（引物由北京金唯智公司合成），以本课题组前期获得的p ET29b（+）-Gly m 4l和p ET29b（+）-Gm PR10质粒为模板进行PCR扩增：扩增体系为50μL，5×Fast Alter‐ation Buffer 10μL，Fast Alteration DNA Polymerase（2.5 U/μL）1.5μL，正反向突变引物10μmol/L各2μL，灭菌dd H2O补足50μL。扩增程序为：95℃预变性2 min，94℃变性20 s，55℃退火10 s，68℃延伸2.5min，18个循环，后68℃补充延伸5 min。质粒模板的消化酶切体系为51μL，PCR产物50μL，限制性核酸内切酶Dpn I（20 U/μL）1μL，混匀后置于37℃条件下消化1 h。将经过PCR扩增及消化后得到的产物与p MDTM18-T载体（购自Ta Ka Ra公司）进行连接并将连接的产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单克隆斑，经PCR鉴定后，将呈阳性的克隆菌液送到测序公司进行测序（由哈尔滨博士生物公司完成）。