《表1引物与内参序列：余甘子对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响及分子机制》

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《余甘子对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响及分子机制》

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取对数生长期（富集度达80%）的MDA-MB-231细胞，用1×PBS缓冲液洗涤细胞2次，加入1 m L 0.25%胰酶-EDTA消化液，消化3 min左右，加入1 m L完全培养基终止消化，轻柔吹打细胞使其均匀悬浮。按1×105个细胞/孔的密度，接种于6孔细胞培养板，置CO2培养箱（37℃、5%CO2、1%O2）中培养（过夜）。第2日按照实验分组更换含药培养基:对照组加入200μL新鲜完全培养基，实验组加入200μL余甘子药液（c=20μg/m L），每组设3个复孔，继续常规培养24 h后用PBS清洗2次，加入Trizol裂解，按照总RNA提取试剂盒的操作说明提取各组细胞的总RNA。测定RNA浓度及纯度（A260/280在1.8～2.0之间提示RNA的纯度较高）。同时，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。将纯度较高、完整性良好的RNA反转录为cDNA。按后续的反转录反应需要取出相应所需量的总RNA立即进行反转录，反应条件:37℃，15 min×3；85℃，5 sec；4℃，1 min。设计和合成PCR的引物序列见表1。PCR反应条件:95℃，3 min；95℃，5 s；60℃，30 s；72℃，30 s。共40个循环。每个样品重复3次，反应结束后确认Rtime PCR的扩增曲线和溶解曲线，用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。