《表1 反硝化与厌氧氨氧化功能基因引物》

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《宛山荡农田土壤氮迁移过程反硝化与厌氧氨氧化》

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采用FastDNA Spin Kit（MP，Biomedicals，CA，USA）从0.5 g经冷冻干燥的土壤/沉淀物样品中进行细菌DNA的提取．使用Nanodrop 2000UV-Vis分光光度计（Thermo Scientific，USA）检测提取DNA的浓度和纯度．为比较各土壤样品中功能基因的绝对丰度，在ABI 7500系统（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）中进行反硝化功能基因nir S、nirK和nosZ，厌氧氨氧化功能基因ANAMMOX bacterial 16S rRNA（amx）[16～18]的qPCR分析，细菌16S rRNA高变区V4/V5段扩增的正向引物是515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGG-3'），反向引物是907R（5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3'）[19]，各功能基因引物信息如表1所示；反应体系为:2X Taq Plus Master Mix 10μL，引物F（5μmol·L-1）0.8μL，引物R（5μmol·L-1）0.8μL，模板DNA 1μL，ddH2O7.4μL；反应条件为:95℃预变性5 min，循环1次，95℃变性30 s，退火30 s（nir S、nir K、nosZ和amx退火温度分别为50、55、58和50℃），循环35次，72℃延伸1 min．使用纯化后的PCR样品在上海美吉生物医药科技有限公司的Illumina Mi Seq测序平台（Illumina Inc.，USA）进行测序，所得到的数据在该公司I-Sanger云平台（www.i-sanger.com）分析，去除低质量序列并进行筛分后，选用相似水平为97%的OTU样本，最终可得到微生物群落组成信息，即不同细菌的相对占比．