《35S驱动Pib基因启动区和编码区的转基因分析》高清PDF

稻瘟病是水稻生产中的重要病害之一，严重影响水稻产量。解决这一难题的办法是培育抗病品种，常规育种比较费时，通过基因工程的方法将抗病基因导入感病水稻品种中，不仅有十分重要的理论意义还有非常重要的应用价值。Pib基因是水稻中第一个被克隆的抗稻瘟病基因，属于NBS-LRR抗病基因家族。Pib基因通过筛选基因组文库得到，所获得的10.3kbDNA片段包含该基因启动区和完整的编码区以及3’非翻译区。Pib基因的克隆为在分子水平研究抗病基因结构和功能之间的关系提供了材料。根据Pib基因的结构特点，本实验利用CaMV35S强启动子驱动Pib基因不同的DNA片段，探索Pib基因结构与抗病功能之间的关系以及在抗稻瘟病育种中的应用。酶切包含Pib基因的pBluescriptSK（+）载体，获得包含Pib基因启动区和完整编码区的9.9kbDNA片段，连接到pPZP2Ha3（+）载体中，构建了35S驱动的正义表达载体pNAR701；通过PCR的方法获得Pib基因编码区完整的第三个外显子DNA片段，并连接到双元表达载体pPZP2Ha3（+-）中，构建了35S驱动的正义表达载体pNAR702和35S驱动的反义表达载体pNAR703；同样通过PCR的方法得到Pib基因完整的编码区片段，连接到pPZP2Ha3（+）载体中，构建了35S驱动的正义表达载体pNAR704。以农杆菌介导的方法转化中感稻瘟病水稻品种R109和Kittake，共获得27株转基因植株。PCR、Southernblot分析表明，目的基因已经整合到R109和Kittake基因组中。大部分转基因植株T0代种子对潮霉素抗性出现3：1分离，表明潮霉素基因在转基因后代中能够稳定遗传。Northernblot分析显示包含Pib基因启动区和编码区的DNA片段在35S驱动下能够在转基因后代中表达。上述结果表明，本实验成功获得了转Pib基因不同DNA片段的转基因植株，目的基因稳定整合到R109和Kittake基因组中，并能在转基因后代中稳定遗传和表达。T1代转基因植株苗期抗稻瘟病鉴定发现，转Pib基因启动区和编码区9.9kbDNA片段的转基因植株对稻瘟病的抗性较对照R109增强；转反义片段的转基因植株则较对照感病。对分蘖期叶片进行进一步离体鉴定，所得结果与苗期结果类似。将Pib基因启动区与GUS报告基因融合，通过农杆菌介导法转入R109，对已获得的T2代材料进行GUS活性检测，分析Pib基因启动子对不同环境条件的响应。经24h黑暗处理，叶和根里GUS活性明显增加，且根里GUS活性较高，达到叶中GUS活性的5倍，表明Pib基因的表达具有组织特异性。在模拟昼夜变化过程中，叶和根中GUS活性均表现出一定的昼夜节律性，白天15:00GUS活性水平较低，03:00达到峰值。在黑暗和模拟昼夜变化条件下进行不同的温度处理，结果显示随着温度的升高，叶和根中GUS活性均有不同程度的升高。上述结果表明，Pib基因启动子受黑暗、温度和昼夜变化等环境因素的调控。

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