《表1 引物序列：牦牛不同肌肉组织的肌内脂肪含量与脂肪代谢相关基因表达的相关性分析》

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《牦牛不同肌肉组织的肌内脂肪含量与脂肪代谢相关基因表达的相关性分析》

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采用TRIzol方法[1]提取小黄瓜条、辣椒条和外脊的肌肉样品总RNA，即100 mg肌肉样品加入1 mL TRIzol后匀浆，4℃10 000×g离心10 min，保留澄清的匀浆液加入0.2 mL氯仿，振荡15 s后静置15 min，4℃12 000×g离心15 min，收集上清液加入0.5 mL异丙醇，放置10 min，4℃12 000×g离心8 min，弃上清，用1 mL 75%乙醇清洗RNA沉淀，4℃7 500×g离心5 min后弃上清，晾干RNA沉淀后加入无RNase水溶解沉淀，得到总RNA。用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。用NanoDrop 2000(Thermo Scientific，USA）分析样品总RNA的浓度。参考TaKaRa逆转录试剂盒说明书将肌肉样品总RNA反转录为cDNA，即4μL(400 ng）总RNA加入1μL随机引物，72℃5 min，42℃5 min，接着加入MgCl24.8μL、3.7μL DEPC水、4.0μL 5×反转录缓冲液、1.0μL ImProm-IITM Reverse Transcription System、1μL dNTP，42℃1 h，70℃15 min。采用Primer Premier 5.00软件根据GenBank中公布的牛的基因序列设计β-肌动蛋白、SCD1、SREBP-1、FAS、PPARγ、HSL和CPT-1基因的引物序列（表1）。用美国伯乐CFX96实时定量PCR仪测定基因表达水平。反应体系为20μL：上、下游引物（10μmol/L）各0.4μL，6μL cDNA，10μL2×FAS t SYBR?Green Master Mix，3.2μL无菌水。反应程序：95℃2 min，95℃5 s，58℃30 s，40个循环。以β-actin为内参，用2-ΔΔCt计算基因表达量。