《表1 用于qPCR分析的基因引物列表》
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《"雄激素1,4-雄烯二酮和雄烯二酮对斑马鱼胚胎昼夜节律和下丘脑-垂体-性腺轴通路中基因转录表达的影响"》
注:a引自Shi等[28];b引自Shi等[30];c引自Liang等[33];d引自Liang等[34]。
根据笔者课题组前期已经建立好的方法[31-32]进行RNA提取、c DNA合成和实时荧光定量PCR分析。具体如下:利用Trizol方法提取胚胎中的RNA;使用Smart SpecTMPlus Spectrophotometer(Bio Rad,USA)检测RNA质量和浓度;所有RNA样品的260 nm和280 nm比值在1.8~2.0。使用东洋纺试剂盒(ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix with g D-NA Remover,Japan)将RNA逆转录为c DNA。目标基因引物均参考笔者课题组已发表的论文[28,30,33-34]。引物设计和要求如下:使用batchprimer3设计跨越内含子的引物并利用Primer-BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)分析引物的特异性,再交由上海生工合成;引物的扩增效率均在95%~105%之间。在Applied BiosystemsTMQuantS-tudioTM7 Flex平台上进行荧光定量PCR分析。反应体系如下:总体积为20μL,包括10μL THUN-DERBIRD SYBR?q PCR Mix试剂(Toyobo),0.4μL上游引物,0.4μL下游引物,2.5μL c DNA样品和6.7μL DEPC水。反应条件为:预变性后,在95℃×15 s、60℃×60 s进行40个循环。引物信息如表1中所示。Shi等[28]的研究已表明,斑马鱼长期暴露于去氢孕酮(dydrogesterone,DDG)后,RpL13α、Actin-β和EF1-α这3个内参基因表达均非常稳定。Liang等[29]的研究也表明,斑马鱼胚胎分别暴露于炔雌醇(17α-ethinylestradiol,EE2)、甲炔诺酮(norgestrel,NGT)和EE2+NGT中96 h后,上述3个内参基因转录表达都非常稳定。因此,qPCR的结果利用RpL13α、Actin-β和EF1-α这3个内参基因转录表达水平的平均值对目标基因进行归一化分析。然后,采用-ΔΔCT方法分析目标基因相对于内参基因的差异表达倍数[35]。
图表编号 | XD00171320500 严禁用于非法目的 |
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绘制时间 | 2020.04.01 |
作者 | 马栋栋、蒋宇霞、杨雷、应光国、史文俊 |
绘制单位 | 华南师范大学环境研究院广东省化学污染与环境安全重点实验室华南师范大学环境理论化学教育部重点实验室、中国科学院广州地球化学研究所有机地球化学国家重点实验室、中国科学院广州地球化学研究所有机地球化学国家重点实验室、华南师范大学环境研究院广东省化学污染与环境安全重点实验室华南师范大学环境理论化学教育部重点实验室、华南师范大学环境研究院广东省化学污染与环境安全重点实验室华南师范大学环境理论化学教育部重点实验室 |
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