《表2 等电聚焦参数:砂藓总蛋白质提取方法的选取及双向电泳体系的建立》
第一向等电聚焦电泳(isoelectric focusing,IEF)的等电聚焦系统为GE Healthcare Ettan IPG phor3。选用24 cm IPG胶条,将蛋白质样品与水化液(7 mol/L尿素,2 mol/L硫脲,2%v/v CHAPS,65 mmol/L DTT,0.5%v/v IPG Buffer,0.002%溴酚蓝)充分混合,终体积为450μL,在20℃条件下开始等电聚焦(表2),聚焦完毕后将胶条进行平衡,首先加入10 m L的SDS平衡缓冲液Ⅰ(6 mol/L尿素,75 mmol Tris-HCl pH值8.8,29.3%v/v甘油,2%v/v SDS,0.002%溴酚蓝,1%w/v DTT),混匀后平放在摇床上平衡15 min,倒出缓冲液在滤纸上胶面朝上沥干缓冲液后向其再次加入SDS平衡缓冲液Ⅱ(6 mol/L尿素,75 mmol Tris-HCl pH值8.8,29.3%v/v甘油,2%v/v SDS,0.002%溴酚蓝,2.5%碘乙酰胺),再平衡15 min。平衡结束后进行第二向垂直SDS-PAGE电泳,使用GE Healthcare Ettan DALTslx电泳系统。SDS-PAGE胶浓度为12.5%,厚度为l mm。冷凝系统温度设为15℃,开始功率为3.5 W/gel,待溴酚蓝浓缩成一条线并距离IPG胶条2 cm左右,加大功率至17.5 W/gel,待溴酚蓝指示剂与底部边缘距离2 cm左右电泳结束。
图表编号 | XD00147629300 严禁用于非法目的 |
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绘制时间 | 2020.06.25 |
作者 | 沙伟、李雯煜、张丽丽、张梅娟、马天意 |
绘制单位 | 齐齐哈尔大学生命科学与农林学院、齐齐哈尔大学抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江重点实验室、齐齐哈尔大学生命科学与农林学院、齐齐哈尔大学抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江重点实验室、齐齐哈尔大学生命科学与农林学院、齐齐哈尔大学抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江重点实验室、齐齐哈尔大学生命科学与农林学院、齐齐哈尔大学抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江重点实验室、齐齐哈尔大学生命科学与农林学院、齐齐哈尔大学抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江重点实验室 |
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