《表3 红花与数据库中红花及近缘物种的K2P遗传距离》

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《紫芸解毒止痛酊中红花的质量控制及其促骨髓间充质干细胞增殖的作用》

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称取50.0 mg干燥红花药材，加液氮充分研磨后提取总DNA，然后进行ITS2序列的PCR扩增。PCR反应体系为50.0μL，其中，正、反向引物各1μL，DNA模板为8μL，2×Taq PCR MasterMix 25μL，ddH2O 15μL。采用文献的ITS2通用引物设计，PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增成功后送样进行双向测序[5]。测序结果采用Codon Code Aligner 2.0拼接软件基于Hidden Markov Model（HMM）的注释方法切除两端5.8S和28S区域，获得完整的ITS2基因间隔区序列。从NCBI数据库下载红花同物种及相关近缘物种的ITS2序列。运用MEGA 7.0进行多序列比对和Kimura two-parameter（K2P）进化距离分析，采用邻接法（Neighbor Joining，NJ）)构建系统进化树。根据ITS2数据库（http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/）预测ITS2序列的二级结构。研究涉及的红花样本ITS2间隔序列共11条（表1），ITS2序列的长度和GC的含量见表2；对红花ITS2序列种内分析发现:碱基序列的长度一致，GC碱基量差异小，在56.76%～57.21%，仅出现第49位碱基的C-T突变；与毛红花、藏红花近缘物种的序列分析显示:红花与毛红花的序列差异大，有120个碱基差异，与藏红花序列仅有12个碱基差异序列。表3中K2P遗传距离分析发现:红花种内遗传距离明显小于近缘物种间遗传距离。构建NJ系统进化树分析发现:红花聚类到红花分支，红花、毛红花和藏红花各自聚类为一支（图1）。进一步的ITS2序列二级结构预测和差异分析结果显示:ITS2序列在螺旋Ⅱ和Ⅲ区的结构长度和组成差别明显，红花ITS2序列二级结构能与近缘物种明显区分（图2）。