《一种定时定量荧光RT-PCR检测马尾松GGPPS基因相对表达量方法》

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课题来源与背景:针叶树可分泌大量以萜烯类化合物为主要成分的有特定气味的树脂,也称之为松脂,是重要的工业原料,长期以来为人们所研究和开发利用。马尾松是中国最主要采脂树种,中国有90%以上的树脂是采自马尾松。在松脂成分中,松香含量占70-75%,而松香的主要成分树脂酸是一类二萜化合物,GGPP是树脂酸的直接前体。GGPPS基因的表达丰度在一定程度上反映了植物二萜合成链的活跃程度,GGPPS基因表达水平相对较高的马尾松植株,其体内的二萜化合物合成相对较多,交脂力可能相对较高。该发明建立的检测马尾松GGPPS相对表达量的方法,可为选育高产脂力马尾松优良品种提供分子辅助育种的理论基础和技术支持。技术原理及性能指标:荧光定量PCR利用荧光染料对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,通过荧光信号和反应循环数计算比较样品模板的初始浓度。荧光定量PCR对扩增过程中的应该信号进行全程实时检测,反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰,是一种便捷可靠的新定量检测技术。该发明在设计特异性引物的基础上,建立了马尾松GGPPS基因相对表达量的检测方法,可以特异性的检测分析马尾松针叶、茎、根系等类型组织样本中的GGPPS基因相对表达量。在实施例中对以上4种植物主要的组织样本进行检测,检测数据重复性好,并且标准差均在1%以下,检测结果可信度高。技术的创造性与先进性:该发明方法根据马尾松GGPPS基因序列,经过分析设计得到一对特异引物,引物特异性强,扩增效果和重复性好,荧光定量RT-PCR检测其扩增曲线和溶解曲线表现好,适用于马尾松针叶、茎、根等各种类型的组织样本,而此前针对马尾松GGPPS基因的表达量分析并未有相关研究报道和专利公布。常规半定量RT-PCR技术在PCR扩增之后还需要需要通过PCR产物电泳、图像扫描处理后根据条带亮度来分析计因表达量,这些PCR后处理步骤操作繁琐,并且其中操作的不稳定性会对最终结果带来很大影响。该发明方法采用的实时定量RT-PCR技术,通过仪器在扩增过程中实时测读荧光信号,不需PCR后处理,实验操作简便快捷,并避免引入其他误差因素,提高了结果的稳定性和重复性,荧光检测的灵敏度高、特异型强,其结果是直接读取的数字化荧光信号,易于标准化。该发明方法对马尾松GGPPS基因的表达丰度在一定程度上反映了植物二萜合成链的活跃程度,马尾松GGPPS基因表达水平相对较高的马尾松植株,其体内的二萜化合物合成相对较多,产脂力可能相对较高。该发明建立的检测马尾松GGPPS相对表达量的方法,可为选育高产脂力马尾松优良品种提供分子辅助育种的理论基础和技术支持。技术的成熟程度,适用范围和安全性:适用于检测分析马尾松针叶、茎、根系等类型组织样本中的GGPPS基因相对表达量,重复性好,可为选育高产脂力马尾松优良品种提供分子辅助育种的理论基础和技术支持。

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