《自噬在弓形虫速殖子与缓殖子转化过程中的作用研究》

点击下载 ⇩

细胞自噬(autophagy)是一种高度保守的细胞生物学行为,研究证实真核生物普遍有自噬现象的发生,且机制差异不大,当细胞在某些因素刺激时,如营养匮乏等,细胞内受损伤的细胞结构以及生命活动暂时不需要的生物大分子等就可以经自噬途径被降解,同时降解形成的小分子物质就能成为新细胞器构建的再生能源。因此,自噬不仅被认为是细胞的自救行为,也似一个"回收工厂"。 在这个复杂的自噬机制中,自噬体的形成是自噬发生的关键环节。其中自噬相关蛋白8(autophagy-related gene protein 8,Atg8)则是自噬体膜延伸形成自噬体这一过程的核心元素,而它功能的发挥与泛素样蛋白系统Atg7-Atg3连接体系的加工修饰密不可分。首先,Atg8经蛋白酶Atg4水解作用暴露出C端的甘氨酸残基,而后该甘氨酸残基的羧基与类E1酶(泛素活化酶)Atg7的半胱氨酸残基(Cys)形成高能硫酯键,从而被激活,激活后的Atg8再与E2酶(泛素结合酶)Atg3形成Atg8-Atg3复合体,最后与PE以酰胺键形式结合成Atg8-PE复合体,并与膜紧密连接参与自噬体膜的延伸。所以Atg8蛋白对于自噬体的形成必不可缺,是公认的自噬体观察的分子标志物,而Atg7和Atg3则是该过程顺利进行的重要辅助工具。 刚地弓形虫是一种专性细胞内寄生性原虫,它能感染包括人在内的几乎所有有核细胞,引起严重的人兽共患寄生虫病,即弓形虫病(toxoplasmosis)。已证实一些寄生性原虫体内,当处于营养缺乏的环境或应激条件下,虫体可通过细胞自噬诱导虫体分化。对恶性疟原虫研究发现,当子孢子进入肝细胞后,即不再需要微线体与棒状体等参与虫体粘附、入侵有关的细胞器,因此虫体会启动细胞自噬途径以清除这些细胞器,所获能量则用于裂体增殖。但有关弓形虫体内的细胞自噬在弓形虫生存、繁殖中作用的研究报道并不多。该课题对弓形虫自噬进行了系统研究,其意义主要有以下几点:证实了弓形虫体内自噬现象的存在通过与酵母相关自噬基因的BLAST比对发现,弓形虫基因组中同样未发现Atg5-Atg12连接体系的同源序列,但存在Atg3、Atg7与Atg8这3个高度同源序列以及调控自噬的TOR激酶、PI3K激酶的编码基因。这个结果不仅表明弓形虫体内具备自噬机制启动及进行的核心材料,也暗示着弓形虫体内自噬体的形成并不需要Atg5-Atg12连接体系,推测它体内可能存在着某些特有的蛋白或者一些特殊的途径来完成这项功能。此外,经透射电镜发现,自噬诱导后的弓形虫胞浆内存在自噬体样结构及自噬降解泡样结构,空泡数量也明显比自噬前增多,较生物信息学的理论分析结果,这些现象从现实依据上进一步证实了弓形虫体内自噬现象的存在。制备了特异性抗TgAtg8、3多克隆抗体该实验所制备的兔抗TgAtg8多克隆抗体不仅效价高、特异性强,还可识别弓形虫内源性TgAtg8。利用该多克隆抗体大大有利于弓形虫自噬机制的进一步研究,具有重要的应用价值。此外,该实验还制备了能特异性识别弓形虫内源性TgAtg3蛋白的兔抗TgAtg3多克隆抗体,还利用该抗体证实TgAtg3蛋白以可溶形式存在于胞浆中,在接下来的实验中,该抗体还会发挥更多使用价值。制备了TgAtg7-HA转基因虫株该课题利用LIC克隆、转染等构建了转基因虫株,经过观察发现,与TgAtg3、8蛋白水平变化相反,TgAtg7蛋白在缓殖子期呈升高趋势,提示其在速缓殖子转化过程中发挥着重要的功能。因此,该转基因虫株为进一步研究TgAtg7的变化提供了至关重要的实验材料。证实虫体自噬参与了弓形虫速缓殖子转化过程该课题通过调控自噬体形成中3个关键Atg蛋白的转录水平与蛋白水平进行观察,发现自噬水平在速殖子期升高,而缓殖子期显著下降。提示虫体自噬参与了弓形虫速缓殖子转化。由于弓形虫属胞内寄生性原虫,若寄生于细胞内,很少面临营养缺乏。然而,当虫株出胞后一直到再侵入到邻近细胞中这段时间内,虫体如何应对应激反应,并不清楚。该课题研究发现表明,在虫体出胞后,虫体可能通过增强自噬水平来为自身提供营养,同时有可能通过自噬清除一些虫株,以达到控制虫体密度,进而躲避宿主免疫反应。

  1. 下载详细PDF版/Doc版

提示:为方便大家复制编辑,博主已将PDF文件制作为Word/Doc格式文件。