《表1 Nsp2和ORF5引物序列》

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《新疆NADC30-like PRRSV的分离鉴定及遗传变异分析》

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样品核酸提取按照病毒基因组提取试剂盒来操作。25μL RT-PCR反应体系包含10×One Step RNA Buffer 2.5μL，10 mmol·L-1 dNTP Mixture 2.5μL，25 mmol·L-1MgCl25μL，5 U·μL-1 AMV RTase XL1μL，5 U·μL-1 AMV-Optimized Taq 1μL，40 U·μL-1RNase Inhibitor 0.5μL，20μmol·L-1上下游引物（表1）各0.5μL，核酸模板1μL，最后加入RNase Free d H2O至终体积25μL。RT-PCR反应程序如下：50℃30 min；94℃2 min；94℃30 s，56.8℃30 s，72℃1 min，进行30个循环；72℃10 min，4℃保存。1.0%浓度琼脂糖凝胶电泳约20 min后观察结果。RT-PCR扩增产物纯化后送上海生工生物工程有限公司进行测序。将获得的Nsp2和ORF5基因序列用DNA Star分析软件与所选参考毒株核苷酸序列进行同源性比较及遗传进化分析，并绘制进化树。