《表1 引物序列信息：利用CRISPR/Cas9和piggyBac实现果蝇基因组无缝编辑》

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《利用CRISPR/Cas9和piggyBac实现果蝇基因组无缝编辑》

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斜体下划线分别为酶切位点Eco RⅠ和Acc65Ⅰ序列，仅下划线为同义突变碱基，粗体下划线为点突变碱基，粗体为TTAA序列。

将pGX-attP载体（载体详情见参考文献[19]）上两个多克隆位点之间的attP-hsp70-white（从Acc65Ⅰ位点至SpeⅠ位点）替换为两端带有piggyBac转座酶识别位点ITRs的Ds Red标记基因，获得载体pGX-DsRed。在目标突变位点附近寻找TTAA位点作为标记基因插入位置，在此序列前后各约1.2 kb和1.1 kb分别设计5′同源臂和3′同源臂，同源臂扩增使用的PCR酶为Phanta高保真酶（南京诺唯赞公司）。扩增5′同源臂的引物为FW3、RV3、FW4和RV4（序列见表1），为了引入突变碱基，本研究将5′同源臂分成2部分进行扩增。由于供体DNA质粒中包含sgRNA序列，为防止供体质粒注入果蝇胚胎后被Cas9切割，本研究对这部分序列中的3个氨基酸进行了同义突变（GGT→GGA，AAT→AAC，ATC→ATT），同时扩增过程中还在FW3引物中引入了点突变（TAT→TGT），编码氨基酸由酪氨酸变成半胱氨酸。3′同源臂扩增引物为FW4和RV4（序列见表1）。为保证DsRed标记在后续实验过程中顺利移除，5′同源臂的3′端和3′同源臂的5′端均带有TTAA序列，这样经piggyBac转座酶处理后才能得到无缝效果。扩增得到的片段使用多片段同源重组酶（南京诺唯赞公司）进行连接。